Monitoreo de la viabilidad fúngica durante un tratamiento de bioaumentación de suelo contaminado con Bifenilos Policlorados (PCBs)

TATARIN, A.S.; SADAÑOSKI, M.A.; BARCHUK, M.L.; ZAPATA, P.D.; VILLALBA, L.L.

Posadas, Misiones

Jornada; Jornadas Científico Tecnológicas 45° Aniversario UNaM; 2018

Universidad Nacional de Misiones

La bioaumentación es una estrategia prometedora para remediar sitios contaminados con PCBs que consiste en la incorporación de microorganismos alóctonos al suelo. El objetivo del presente trabajo fue monitorear la viabilidad fúngica durante un tratamiento de bioaumentación con co-cultivo de Pycnoporus sanguineus (A60) y Pleurotus sajor-caju (B60), mediante aislamiento e identificación morfológica y molecular. La preparación del inóculo se realizó inmovilizando P. sanguineus y P. sajor-caju en bagazo de caña de azúcar. Luego, éste se mezcló con suelo no estéril contaminado artificialmente con PCBs en proporción 1:3 (p/p). Se tomaron muestras destructivas a los 14, 42 y 60 días a partir de las cuales se realizó el aislamiento por siembra directa en placas con extracto de malta agar suplementadas con bagazo al 0,01%, ampicilina al 0,05% y carbendazim-50 al 0,001%. Las colonias con características macroscópicas de agaricomicetes fueron re-aisladas y observadas en M.O. Para la identificación molecular se extrajo ADN genómico a partir de micelio crecido en medio líquido conteniendo extracto de malta que se incubaron por 5 días a 29±1°C. Se estandarizaron las condiciones de PCR para la amplificación de la región ITS utilizando los cebadores ITS1 e ITS4. La reacción se llevó a cabo utilizando 1 U de enzima Taq polimerasa en un volumen final de 20 μL conteniendo 1X de Taq buffer, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 10 pmol de cada uno de los cebadores y 60 ng de ADN genómico como molde. Para la visualización del ADN genómico y la separación de los productos de PCR se realizó electroforesis en geles de agarosa al 1% (p/v) y al 2% (p/v) respectivamente. Los productos obtenidos fueron enviados a secuenciar por los servicios de Macrogen-Corea. Se recuperaron las tres primeras secuencias del alineamiento homólogas del reino Fungi mediante el programa Blastn y se complementaron con secuencias de especies de Trametes sp. y Pleorotus sp reportas en la bibliografía. El dendrograma se realizó utilizando el programa MEGA 7.0, según el método de Neighbour- Joining (NJ) con un boostrap de 1000 repeticiones. Como resultado se logró re-aislar e identificar morfológicamente las cepas inoculadas al inicio de los tratamientos de monocultivo, sin embargo en el co-cultivo sólo se identificó la cepa P. sanguineus LBM 023 todos los días estudiados. En cuanto a la identificación molecular, el alineamiento de la secuencia obtenida para A60 y AB60 con la base de datos disponibles en el NCBI, mostraron una identidad del 99% con P. sanguineus. El dendograma mostró que P. sanguineus se ubicó dentro del grupo Trametes ya que no presenta diferencia genética con Trametes sanguínea. Los resultados del alineamiento de la secuencia obtenida para B60 con la base de datos disponibles en el NCBI, mostraron una identidad del 97% con Lentinus sajor-caju. Para este caso la cepa identificada se agrupó con Lentinus sajor-caju y Pleurotus pulmonarius, los cuales serían sinónimos de P. sajor-caju.