Identificación de bacterias lácticas de interés enológico aplicando técnicas moleculares

NOCERA D.; MERCADO L.; CIKLIC I.; ROJO M.C.; MASSERA A.; COMBINA M.

Montevideo, Uruguay

Congreso; XII Congreso Latinoamericano de Viticultura y Enología.; 2009

Las bacterias ácido lácticas (BAL) están naturalmente presentes durante todas las etapas de la elaboración del vino, se pueden aislar de las hojas de la vid, de la uva, del equipamiento de la bodega,  las barricas y el vino. Los géneros más frecuentemente aislados a partir de mostos y vinos son: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus.  La especie O. oeni, es la responsable de llevar a cabo la fermentación maloláctica, la cual es muy importante para desacidificar los vinos, aumentar la estabilidad biológica y la complejidad aromática de los mismos. Por otro lado, la presencia de BAL también puede tener consecuencias negativas para el vino, debido a su capacidad para producir alteraciones que disminuyen la calidad del producto final, tales como: cambios en la viscosidad, picadura láctica, fermentación manítica y producción de aminas biógenas, entre otros. Para la industria del vino es importante disponer de un método rápido y confiable para la identificación de BAL, tanto a nivel de especie como de cepa, ya que permite una adecuada toma de decisiones. El objetivo del presente trabajo fue poner a punto la técnica molecular 16S-ARDRA para la identificación de bacterias lácticas de importancia enológica y evaluar la confianza del método para la correcta asignación de las especies. Para la puesta a punto de la técnica se trabajó con 6 cepas de referencia de diferentes especies, optimizando en primer término las condiciones de cultivo y extracción de ADN genómico. Para la extracción de ADN se evaluaron tres protocolos que incluían: un método rápido de extracción a partir de una colonia, un método recomendado para bacterias en general (miniprep) y uno recomendado para Listeria. Luego de la puesta a punto, la técnica fue evaluada en diferentes cepas nativas previamente identificadas por otros métodos y cepas no identificadas. Los resultados fueron confirmados por secuenciación del gen 16S seguido de alineación de la secuencia obtenida con bases de datos on-line. Los resultados mostraron que las condiciones de cultivo fueron determinantes para el éxito en los pasos posteriores. Independientemente de la especie, las condiciones elegidas fueron: desarrollo de 24 horas a 28 ºC en caldo MRS con jugo de tomate (15%). Cultivos de mayor tiempo de incubación, a pesar de aumentar la biomasa, afectaron la cantidad y calidad del ADN obtenido. El protocolo más adecuado para la extracción de ADN fue la mini-preparación de ADN, debido a la robustez y eficiencia en la extracción, su simpleza y menor costo. Se optimizaron las diluciones a utilizar para la amplificación del gen 16S y la digestión con las enzimas de restricción; obteniéndose un elevado éxito en las amplificaciones y digestiones con las condiciones elegidas. Una vez obtenidos los perfiles de restricción, la asignación de las especies presentó cierto nivel de incertidumbre, ya que los patrones de restricción disponibles son limitados y no existe una base de datos on-line. Los perfiles de restricción obtenidos permitieron asignar la cepa a una o dos especies dentro de un mismo género, debiendo recurrir a la secuenciación para confirmar la identificación definitiva. La secuenciación del amplificado no es sencilla, ya que es un fragmento de 1500 pb y en la mayoría de los casos no se obtuvo la secuencia completa. De acuerdo a los resultados obtenidos se puede recomendar 16S-ARDRA para agrupar cepas con similar patrón de restricción e identificación presuntiva, debiendo confirmar la especie mediante secuenciación de cepas representativas de cada patrón de restricción.