Producción batch de celulasas por Irpex lacteus nativo de Misiones

RODRÍGUEZ, M. D.; FLACH, G.; ZAPATA, P. D.; VILLALBA, L. L.

Encarnación

Jornada; II Jornada Internacional de Biotecnología para el Desarrollo Sostenible; 2019

El costo de las enzimas es un factor que determina la economía de un proceso biocatalítico y puede reducirse optimizando su producción. El objetivo del trabajo fue producir celulasas mediante la cepa Irpex lacteus BAFC 1171 nativa de Misiones en sistema de fermentación tipo batch. Para el inóculo, se sembró la cepa en placas de Petri conteniendo medio agar-extracto de malta y se incubó por 7 días en estufa a 29±1 °C. Transcurrido ese tiempo se tomaron 8 tacos del borde de las placas de Petri, se inocularon en Erlenmeyers de 500 mL conteniendo 100 mL medio Mandels suplementado con 5 g/L de glucosa en Erlenmeyers y se llevaron a estufa por 7 días a 29±1 °C. Transcurrido ese tiempo los micelios se lavaron en agua destilada estéril y se trituraron en buffer acetato de sodio 0,05 M y pH 4,8 con 0,1% v/v de tween 80. Para el cultivo se preparó 400 mL de medio de cultivo Mandels optimizado (MgSO4 7H2O 0,3 g/L; CaCl2 2H2O 0,3 g/L; KH2PO4 3 g/L, extracto de levadura 0,25 g/L; (NH4)2SO4 0,7 g/L; urea 0,42 g/L) suplementado con harina de eucalipto y pino 15 g/L cada una, a pH 5 en un frasco Schott de 500 mL, al cual se le colocó una entrada y salida de aire con filtros de 0,45 µm, y un imán para proporcionar agitación mecánica. El medio se inoculó al 14% v/v con el micelio triturado y se llevó a estufa con aireador y agitación magnética a 29±1 °C. Se tomaron muestras de 1,7 mL al tiempo 0 y cada 48 h de cultivo. Se midió el pH y la actividad celulolítica de cada muestra. La actividad endoglucanasas (EGs) fue determinada por la medición de azúcares reductores liberados de una solución de carboximetilcelulosa sódica (CMC) al 2% p/v en buffer de acetato de sodio 0,05 M a pH 4,8 (sustrato). Se incubó 0,1 mL de sustrato y 0,1 mL de enzima a 50 ºC por 30 min. Para determinar el contenido de azúcares reductores, se agregó 0,6 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y se dejó en baño de agua hirviente durante 5 min. Se diluyeron todos los tubos con 4 mL de agua destilada y se midió la absorbancia a 540 nm contra sus blancos. Se calculó el contenido de azúcares reductores como glucosa. Las determinaciones se realizaron por triplicado. Una unidad de EGs se definió como los µmoles de glucosa liberados por min bajo las condiciones descritas. El cultivo se mantuvo por 264 h y el pH fue constante durante todo el cultivo. La mayor actividad de EGs fue de 377 U/L y se obtuvo a las 144 h de cultivo, luego comenzó a descender hasta las 260 U/L. Como el pH del medio fue constante durante el transcurso del cultivo, no fue necesario ajustarlo. Una alternativa para aumentar la producción celulolítica, se podría ensayar mediante una fermentación fed-batch, con la alimentación posterior a las 144 h que fue el momento de mayor producción en el sistema batch.