KH2PO4 MAXIMIZA LA SECRECIÓN DE CELULASAS DE Pycnoporus coccineus, NATIVO DE MISIONES

RODRÍGUEZ, M. D.; ALONSO PAIVA, M. I.; CASTRILLO, M. L.; SEDLER, C. I.; ZAPATA, P. D.; VILLALBA, L. L.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAProBio 2014; 2014

Introducción Los hongos de pudrición blanca, entre los que se encuentra el género Pycnoporus, son los organismos más eficaces para el tratamiento biológico de materiales lignocelulósicos, ya que producen un complejo enzimático denominado, en forma general, celulasas, compuesto por enzimas de endoescisión (endoglucanasas, EGs) y exoescisión (exoglucanasas, CBHs). La celobiosa resultante es procesada por B-glucosidasas (BGLs). Las potenciales aplicaciones de estas enzimas en tecnologías industriales y medioambientales requieren grandes cantidades de las mismas a bajo costo. Es por ello, que existe la necesidad de elaborar estrategias para su sobreproducción. Uno de los enfoques apropiados para este propósito es el uso de residuos lignocelulósicos, los cuales pueden contener concentraciones significativas de hidratos de carbono solubles y de inductores de la síntesis enzimática para asegurar la eficiente producción de celulasas. La metodología de superficie de respuesta (MSR) puede utilizarse para optimizar las concentraciones de las fuentes de carbono y nitrógeno, así como las condiciones del medio de cultivo, para la secreción de celulasas fúngicas. A su vez, varios estudios han comprobado que ajustando la concentración de distintos minerales se maximiza la producción de dichas enzimas. Metodología La cepa Pycnoporus coccineus se mantuvo en heladera a 4ºC en MEA (agar 17 g/L - extracto de malta 12,7 g/L). La misma se activó en placas de Petri de 6 cm de diámetro conteniendo MEA por 5 días a 28ºC. El pre-inóculo consistió en 8 tacos de 6 mm de diámetro en 100 mL de medio líquido estéril para crecimiento de biomasa (SO4N2H8 1,4 g/L, extracto de levadura 0,25 g/L, urea 0,3 g/L, glucosa 5 g/L, MgSO4.7H2O 0,1g/L, CaCl2.2H2O 0,1g/L, KH2PO4 5 g/L, ZnSO4.7H2O 0,02 g/L) contenidos en 4 erlenmeyers de 500 mL. La incubación se realizó Se incubaron a 28±1°C por 9 días. Transcurrido este tiempo se lavaron los micelios en agua destilada estéril y se trituraron con 3 pulsos de 1-2 seg cada uno, en 100 mL de buffer acetato de sodio 0,05 M a pH 4,8 y tween 80 al 0,1%. De esta solución se tomaron 8 mL, DO600=1,26, como inóculo en cada uno de los erlenmeyers del experimento, los cuales fueron incubados a 30±1°C y 80 rpm. Se extrajeron muestras de 1,7 mL a los 3, 6, 9, 12 y 15 días, las cuales se conservaron a -20°C hasta su utilización. Con los resultados obtenidos en un ensayo experimental previo, se diseñó el presente experimento basado en la MSR utilizando el diseño de Box- Behnken para 3 variables (Fe, K, Mg) con 3 niveles y cinco puntos centrales. Todos los experimentos contenían SO4N2H8 1,4 g/L, extracto de levadura 0,25 g/L y urea 0,3 g/L como fuentes de nitrógeno, harina de pino 5 g/L y harina de eucalipto 5 g/L como fuentes de carbono y Cl2Ca 0,1 g/L como fuente mineral constante, resultado del experimento anterior, además de los especificados. Para la determinación de la actividad de EGs, CBHs y celulasas totales se utilizó por el método de la IUPAC y el método del 4-nitrofenil-B,D-glucopiranósido para BGLs por; expresándose las actividades en U/L (µmoles/L min).Los datos se analizaron estadísticamente con el programa informático STATGRAPHICS Centurion XV. Resultados Se analizó el diseño experimental teniendo en cuenta, solamente, los días de mayor actividad enzimática estadísticamente significativos, y considerando como factor los niveles de las fuentes minerales para evaluar sus influencias sobre la actividad enzimática. Luego, se excluyeron los factores e interacciones no significativas al 95% del nivel de confianza. Teniendo en cuenta las 3 enzimas y la acción sinérgica de las mismas, se obtuvo que el KH2PO4 influye positivamente sobre el sistema y el FeSO4.7(H2O) lo hace de manera negativa. Por su parte, el MgSO4.7(H2O) influye cuadráticamente de manera negativa. En el caso de la actividad de EGs y CBHs, ninguna interacción fue estadísticamente significativa. Para la actividad de BGLs y de las celulasas totales, la única interacción estadísticamente significativa fue la del FeSO4.7(H2O)-KH2PO4, influyendo negativamente sobre el sistema. Luego de realizar estos análisis, se obtuvieron los niveles óptimos de cada variable para maximizar la actividad de cada enzima. Conclusiones Para cada una de las enzimas, y para la acción sinérgica de las tres, se obtuvo como resultado los mismos niveles óptimos de cada variable. Se excluirá a FeSO4.7(H2O) ya que el valor recomendado es -1 (ausencia) y se utilizará la concentración óptima de MgSO4.7(H2O) (0,2 g/L). Como referencia para el siguiente experimento de optimización, se utilizará el nivel +1 de KH2PO4,sin embargo como éste influye positivamente sobre el sistema para varias enzimas, podría evaluarse un aumento de su concentración para obtener la máxima secreción de celulasas por la cepa cepa P. coccineus, nativa de Misiones.