DETECCIÓN CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE CELULASAS EN TRICHODERMA KONINGIOPSIS NATIVO DE MISIONES

SEDLER, C. I.; BARENGO, M.; RODRÍGUEZ, M. D.; CASTRILLO, M. L.; ZAPATA, P. D.; VILLALBA, L. L.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAProBio 2014; 2014

Introducción La biomasa celulósica constituye una fuente renovable para la obtención de azúcares solubles. Estos azúcares pueden ser utilizados como sustratos en varios procesos metabólicos, incluyendo su fermentación para la producción de compuestos químicos, productos con valor agregado y biocombustibles. Para lograr la degradación enzimática de la celulosa es necesaria la acción colectiva de un grupo de enzimas conocidas conjuntamente como celulasas. Éstas se clasifican según su actividad catalítica en: (i) endoglucanasas (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanasas, celodextrinasas (EC 3.2.1.74) y celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) y (iii) β-glucosidasas (BGLs) (EC 3.2.1.21). Las endoglucanasas actúan al azar en regiones de celulosa amorfa generando oligosacáridos de longitud variada, las exoglucanasas actúan de forma procesiva en extremos reductores y no reductores de las cadenas de polisacárido liberando tanto glucosa como celobiosa, finalmente las BGLs catalizan la hidrolisis de celodextrinas y celobiosa a glucosa.Uno de los aspectos de mayor impacto en el desarrollo de procesos de obtención de energías alternativas es el hallazgo de enzimas fúngicas con capacidades óptimas para su aplicación en procesos biotecnológicos. El objetivo del trabajo fue evaluar la capacidad celulolítica del hongo Trichoderma koningiopsis autóctono de la provincia de Misiones mediante técnicas cualitativas y cuantitativas. En cuanto a la técnica cualitativa aplicada, evaluar su utilidad para la detección de β-glucosidasas fúngicas ya que suele ser utilizada para β-glucosidasas bacterianas. Metodología Se utilizó una cepa de Trichoderma koningiopsis aislada de la provincia de Misiones por nuestro grupo de trabajo. Primeramente se activó el hongo en placas de Petri conteniedo agar papa dextrosa, como medio de cultivo. Luego, se realizó fermentación en sustrato sólido, conteniendo bagazo de caña de azúcar como fuente de carbono y medio Mandels como fuente de nitrógeno durante 5 días. El inoculó utilizado correspondió a suspensión de esporas con una concentración de 107 esporas/mL Finalmente, se tomaron muestras del material sólido que fueron desorbidas en buffer acetato de sodio y Tween 80, a 70 rpm 15°C durante 3 hs. La fracción soluble obtenida fue utilizada para la determinación de actividad enzimática. La determinación de actividad enzimática para BGLs se realizó cuantitativamente mediante el método de p-nitrofenil-β-glucósido y el efecto sinérgico del conjunto de celulasas mediante el método de papel de filtro (FPU). Adicionalmente, se utilizó la misma fracción soluble para la realización de un zimograma de BGLs en condiciones nativas utilizando como sustrato específico el esculin. La técnica se basa en la conversión de esculin a esculetin, mediante la acción de la enzima, y la posterior precipitación de color negra del esculetin en presencia de ion ferroso.Para ello se realizó primeramente una corrida electroforética en gel de acrilamida en condiciones nativas y se evaluaron cuatro diluciones del extracto crudo (1/20, 1/50, 1/75 y 1/100) a fin de determinar la sensibilidad de la técnica. Resultados Utilizando la fracción soluble del hongo cultivado en las condiciones previamente expuestas se determinó la actividad enzimática para BGLs y celulasas totales (FPU) siendo 348 U/L y 203 U/L, los valores obtenidos respectivamente. Por otra parte, se realizó el zimograma de β-glucosidasa el cual permitió la detección cualitativa de la enzima en la muestra ensayada. La presencia de actividad β-glucosidasa fue detectada en las calles correspondientes a las diluciones 1/50 y 1/20, no así en las diluciones 1/75 y 1/100. Conclusiones Las actividades enzimáticas obtenidas en los extractos crudos permitirían la aplicación de este hongo en procesos biotecnológicos, pudiendo ser aumentada mediante pasos de purificación. Adicionalmente, mediante la técnica de zimograma se logró la visualización de actividad BGLs. Se determinó la sensibilidad de esta técnica para BGLs de origen fúngico siendo ésta 0,0002 U, superior a la reportada para enzimas bacterianas (0,004 U) realizando modificaciones en la concentración de sustrato y tiempo de incubación. La aplicación de esta técnica permitiría profundizar en las características bioquímicas de los sistemas enzimáticos involucrados en la producción de celulasas en hongos.