Modificación de la expresión del receptor tipo toll 4 (TLR4) luego de la aplicación de extracto de Panax ginseng al momento del secado.

MILANESIO, D.; BELTRAMINO, S.; CADOCHE, M.; BARAVALLE, C.; DALLARD, B.E.

Santa Fe

Jornada; XVI Encuentro de jóvenes investigadores de la UNL. VII Encuentro de jóvenes investigadores de Universidades de Santa Fe; 2012

Secretaría de Ciencia y Técnica - Universidad Nacional del Litoral

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos previamente sobre la expresión de TLR4 por RT-PCR a punto final, en el presente trabajo se propuso evaluar la expresión de ARNm para TLR4 por RT-PCR en tiempo real en tejido mamario proveniente de cuartos tratados con PG y placebo al momento del secado. Esto permitirá corroborar los resultados obtenidos utilizando otro método diferente de amplificación de ácidos nucleicos. Se utilizaron 4 vacas Holstein no preñadas en la etapa final de la lactancia. La unidad experimental fue el cuarto mamario. Del total de cuartos disponibles, 8 fueron inoculados con 10 ml de una solución de extracto de PG (3 mg del extracto seco/ml) y 8 con 10 ml de placebo (solución fisiológica). Los animales fueron secados luego de la inoculación y se sacrificaron a los 7 días. Se obtuvieron muestras de tejido de tres zonas diferentes de la glándula mamaria las cuales fueron inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento para la realización de la técnica PCR en tiempo real.  Inicialmente, para el aislamiento del ARN total a partir de un pool de tejido, se utilizó un reactivo comercial (Trizol LS Reagent, Invitrogen). Seguidamente y a los efectos de eliminar posibles contaminaciones de ADN genómico se realizó un tratamiento con la enzima ADNasa (Invitrogen). A continuación se llevó a cabo la transcripción reversa, utilizando la enzima MMLV RT (200U) (Invitrogen), y se adicionó una cantidad constante de ARN previamente tratado. La concentración de ADNc obtenida se cuantificó por un método fluorimétrico (Qubit, Invitrogen). Como primera prueba y para determinar un gen normalizador, cuya expresión sea estable y que nos permita realizar la cuantificación relativa del ARNm de TLR4 en glándula mamaria bovina tratada con PG y placebo, se realizaron pruebas con diferentes cebadores de posibles genes de referencia validados para PCR a tiempo real en bovinos. Sintéticamente, el protocolo de PCR a tiempo real optimizado para cada gen analizado se llevó a cabo utilizando la tecnología SYBR Green I en un StepOne Real Time PCR System (Applied Biosystems). La eficiencia de las PCR (similares para el gen incógnita y el control interno) y las cantidades relativas fueron determinadas por medio de una curva estándar construida a partir de 5 diluciones seriadas de un pool de ADNc. Las eficiencias se calcularon usando un software comercial (StepOne software v2.2.). Para el gen TLR4 y para el gen de referencia elegido se partió de una cantidad de ADNc constante de 10 y 12 ng respectivamente. En todos los casos se sembraron 4μl de ADNc, combinados en un volumen final de 20μl con una solución master mix. Los niveles de expresión de ARNm se cuantificaron como valores de Ct o ciclos umbral. El producto fue confirmado con curvas de disociación y geles de agarosa. El nivel de cambio en la expresión se determinó usando el método 2-ΔΔCt. Una vez finalizadas las pruebas y recolectados los datos arrojados por la técnica de PCR a tiempo real, se llevó a cabo el análisis estadístico, donde las diferencias entre los tratamientos fueron analizadas mediante el test no paramétrico Mann-Whitney, utilizando el software Statgraphics Plus 5.1. De las pruebas con los distintos genes de referencia, se determinó que el más apropiado a utilizar para la cuantificación relativa del TLR4 fue el gen del ARN ribosomal 18S, ya que en la puesta a punto con este cebador se obtuvo una eficiencia calculada del 91% (R2:0,995) y en donde la curva de melting mostró un único producto, determinando así la especificidad de la reacción con el cebador utilizado. Como resultados de la cuantificación relativa entre ambos genes, en cuartos mamarios inoculados con PG a los 7 días del secado, se observó un aumento significativo en la expresión de ARNm para TLR4 en comparación con los cuartos tratados con placebo (P=0,041) (Figura 2). Estos resultados se condicen con los hallados previamente a través de RT-PCR a punto final. A partir de los resultados obtenidos se podría concluir que la aplicación IM al momento del secado de extracto de PG, estimula la expresión de TLR4 utilizando la vía de este receptor como un posible mecanismo de acción. El aumento de la expresión de este receptor en los animales tratados podría influir en la estimulación de la inmunidad innata, promoviendo la activación de factores de transcripción para genes que codifican citoquinas proinflamatorias. Por otra parte, la congruencia hallada con los datos obtenidos en trabajos previos utilizando otra técnica de amplificación de ADNc, valida los resultados aquí presentados.