Uso de marcadores moleculares para investigaciones en el compo veterinario

FLORIN-CHRISTENSEN M, SCHNITTGER L

Mar del Plata

Congreso; XVI Reunion Cientifico Tecnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnostico.; 2006

Los marcadores moleculares son secuencias identificables de ADN, que se encuentran en regiones específicas del genoma y que están asociadas a un gen o a la herencia de una característica. En el campo veterinario, pueden ser usados para (a) cruzamientos asistidos por marcadores; (b) la comprensión y conservación de recursos genéticos; (c) la verificación genotípica. En el caso del mejoramiento genético, cuando las características que se quieren seleccionar están controladas por uno o pocos loci, como la presencia o ausencia de cuernos en el ganado, era posible, ya antes del advenimiento de métodos moleculares, conocer el genotipo de un individuo y usar esta información en programas de cruzamiento. El uso de marcadores moleculares ha permitido la caracterización genotípica con respecto a caracteres controlados por muchos genes, tales como la resistencia a enfermedades, la producción de carne y leche o el porcentaje de grasa. Asimismo, este tipo de métodos es particularmente útil cuando, en programas de selección, deben registrarse las características de animales de la misma familia pero, por el tipo de manejo, no puede rastrearse el parentesco. En el caso del salmón, por ejemplo, se desarrolló un sistema mediante el uso de marcadores moleculares para establecer parentescos entre los pescados, lo cual permite estudiar la herencia de características como el color de la carne y el contenido de grasas. El uso de marcadores moleculares, asimismo, permite evaluar el grado de variación a nivel genético dentro y entre poblaciones, lo cual sirve para guiar las actividades de conservación genética y para mantener poblaciones fértiles de ganado, plantas, o peces. Finalmente, los marcadores moleculares han sido ampliamente utilizados para identificar genotipos y para hacer un “fingerprint” genético de distintos organismos. Se han usado, por ejemplo, en procedimientos de clonado, para identificar los clones adecuados a ser usados en programas de propagación a gran escala. También con ellos se han identificado especies marinas en peligro de extinción capturadas en redes de pesca, y se han usado para estudios de parentesco en animales domésticos así como para rastrear el establecimiento y el animal de origen en productos de granja comercializados. En el caso de microorganismos patógenos, el uso de marcadores moleculares puede permitir, por ejemplo, rastrear el origen de un brote de enfermedad. Existe una gran variedad de marcadores moleculares y métodos para su estudio, entre los que se pueden mencionar los siguientes: 1)RFLP: Restriction fragment length polymorphism (polimorfismo en el largo de fragmentos de restricción) 2) RAPD´s: Random amplified polymorphic DNA (ADN polimórfico amplificado azarosamente) 3) VNTR´s: Variable number of tandem repeats (número variable de repeticiones en tandem, tambien conocidos como microsatelites) 4) SSCP´s: single strand conformation polymorphism (polimorfismo conformacional de cadena simple) 5) SNP´s: single nucleotide polymorphism (polimorfismo ennucleótidos únicos). A continuación se describirán brevemente cada una de estas metodologías. 1) RFLP: Esta técnica se basa en el análisis del tamaño de fragmentos generados cuando se corta el ADN con una enzima de restricción. Como estas enzimas tienen sitios de corte específicos que pueden o no estar conservados entre individuos, se pueden producir fragmentos de distintos tamaños. El uso de una sonda específica que genera una señal y métodos bioquímicos para detectarla permiten la visualización de los fragmentos generados que hibridizan con esa sonda. Esta técnica fue uno de los primeros métodos moleculares para el estudio de polimorfismo. Su desventaja es que requiere cantidades significativas de ADN, pero puede aumentarse su sensibilidad combinándola con PCR. 2) RAPD´s: La complejidad del ADN eucariótico nuclear es lo suficientemente alta como para que si se diseñan oligonucleótidos (primers) al azar, existan regiones complementarias a algunos de ellos que estén lo suficientemente cerca y en la orientación correcta como para permitir su amplificación por PCR. Con algunos de estos primers no habrá amplificación, con otros, se generarán fragmentos de igual tamaño en diferentes individuos porque amplificarán zonas ampliamente conservadas, mientras que con otros, se generarán patrones de bandas diferentes entre individuos. Las distintas bandas de amplificación obtenidas pueden separarse por electroforesis y visualizarse por tinción fluorescente. 3) VNTR o Microsatélites: Dispersos en el genoma de muchos organismos, existen repeticiones de segmentos cortos de ADN, alineados cabeza con cola. El número de segmentos repetidos puede variar de un individuo a otro, o de un conjunto de individuos a otro. Si se amplifica por PCR la región completa que contiene un grupo de secuencias repetidas, se puede estudiar el polimorfismo entre individuos por las diferencias de tamaño entre estos fragmentos. 4) SSCP´s: La movilidad electroforetica de un fragmento de ADN de doble cadena es relativamente independiente de la secuencia de nucleótidos. En cambio, la movilidad de cadenas simples varía considerablemente como resultado de pequeños cambios en la secuencia. Este hecho permitió desarrollar la técnica de SSCP. En este método, se diseñan primers para amplificar una región específica de ADN, usando una PCR “asimétrica”. En esta, uno de los primers se encuentra en exceso con respecto al otro. Cuando se acaba el primer en menor concentración, la reacción sigue produciendo solamente una de las hebras de ADN, que luego es separada por electroforesis para analizar su movilidad. 5) SNP´s: Son variaciones de secuencia en un nucleótido único y constituyen, en el caso del genoma humano, el 90% de las variaciones genéticas. Solo en pocos casos un SNP produce un cambio en el fenotipo, pero pueden ser usados como marcadores moleculares de linaje, ya que estas variaciones son muy estables y se heredan dentro de una familia. También se está investigando intensamente la relación entre diferentes SNPs y la susceptibilidad a enfermedades. Una metodología para su estudio consiste en la amplificación de la región de ADN conteniendo un SNP por PCR y la hibridización a un grupo de oligonucleótidos que varian en una única base, inmovilizados en un chip (microarray), seguido de la detección de la hibridización por fluorescencia. El gran desarrollo que estas metodologías están adquiriendo para el estudio del genoma humano puede resultar en importantes avances en la medicina veterinaria, en particular en el campo de mejoramiento genético, predicción de enfermedades y estudios epidemiológicos.