CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Y MOLECULAR DE AGENTES ETIOLÓGICOS ASOCIADOS A UN BROTE DE DIARREA EN TERNEROS DE TAMBO

LOUGE URIARTE EL; MOREIRA AR; GONZALEZ-PASAYO RA; CSEH S; TOMAZIC ML; MALENA R; LISCHINSKY LH; LLOBERAS MM; SCHNITTGER; PARREÑO GV; ODEON AC

Simposio; XIX Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnostico (AAVLD); 2012

Introducción: La diarrea neonatal de los terneros (DNT) es la principal causa de mortalidad en terneros de 3 a 21 días de vida. A nivel mundial, rotavirus bovino grupo A (RVB-A), coronavirus bovino (CoVB), Escherichia coli (E. coli) y Cryptosporidium son las etiologías más importantes. La septicemia por E. coli es una enfermedad que afecta a terneros neonatos y se relaciona con fallas en la transferencia pasiva (FTP) de anticuerpos calostrales y manejo deficiente. Los objetivos del presente estudio fueron: (i) evaluar la FTP de anticuerpos en terneros de tambo durante un brote de DNT; (ii) identificar y caracterizar molecularmente los agentes infecciosos y parasitarios implicados en el brote. Materiales y métodos: Un tambo del partido de Carmen de Areco, provincia de Buenos Aires, presentaba antecedentes de diarrea y septicemia en terneros de 4 a 11 días de vida; la mortalidad promedio anual era del 41%. Como medida preventiva de la DNT se aplicaba a las madres, previo al parto (60 y 30 días), una vacuna formulada con RVB-A (G6 y G10), CoVB, E. coli K99 y cepa J5, LPS de E. coli, Salmonella Typhimurium y Dublin.Al momento de la visita había un total de 27 terneros en estaca. Se extrajeron muestras de suero (n=12) y materia fecal (MF; n=12), principalmente de animales con diarrea cuya edad promedio era de 9 días (rango: 17).La FTP fue evaluada indirectamente en las muestras de suero midiendo: a) proteínas totales (PT) por refractometría entre las 24 y 48 h de vida; b) PT y actividad de γGT por espectrofotometría entre los 3 y 10 días de vida. Los  valores considerados normales fueron: PT de >5 g/dl; actividad de γGT a los 4 y 7 días de vida, >100 UI/L y >75 UI/L respectivamente.El diagnóstico de RVB-A y CoVB se llevó a cabo por ELISA indirecto de captura; la caracterización de los tipos G y P de  RVB-A en muestras positivas se realizó por RT-PCR heminested multiplex.  La búsqueda de ooquistes de Cryptosporidium spp. se realizó en extendidos de MF teñidos (técnica de Ziehl-Neelsen modificada). El resultado positivo fue confirmado por PCR con primers específicos que amplifican un fragmento hipervariable del gen 18S rRNA, a partir de ADN total extraído de MF. En algunos terneros (n=7) se hizo recuento de coccidios (técnica de Mc Master modificada). El cultivo para Salmonella se realizó por enriquecimiento selectivo de la MF en caldo tetrationato incubado a 37°C y efectuando tres repiques consecutivos en agar XLD a las 24, 72 y 120 h. Para el  cultivo de E. coli, las muestras se sembraron en agar McConkey a 37°C por 18-24 h y del crecimiento confluente se extrajo el ADN, por ebullición, para ser analizado por PCR simple. Se estudiaron 19 genes que codifican factores de virulencia  correspondientes a los patotipos de E. coli asociados a diarrea o septicemia, entre ellos: a) E. coli enterotoxigénico (ETEC; STa,STb,LT,F5 y F41); b) E. coli enteropatogénico (EPEC) típico (Eae y Bfp) y atípico (Eae); c) E. coli shigatoxigénico (STEC) y  E. coli enterohemorrágico (EHEC; Eae, Stx1 y Stx2); d) E. coli patógeno extraintestinal (ExPEC; F17, Pap, Sfa, Afa-VIII, CS31A, CNF1 y CNF2, CDT, aerobactina y hemolisina). Resultados: El 41% de los terneros presentó FTP con valores de PT (prom.± DS= 4,2 g/dl ± 0,6) y γGT (prom. ± DS= 62 UI/L  ±13,4) inferiores a los de referencia. RVB-A fue detectado en el 42% (5/12) de los terneros y las cepas circulantes pertenecieron a los genotipos G6(IV)P[5] (60%; 3/5) y G?P[5] (40%; 2/5). En el 8,3% (1/12) de los animales se hallaron ooquistes de Cryptosporidium, obteniéndose el producto de PCR correspondiente a la región 18s rRNA. En el 28,5% (2/7) se detectaron ooquistes de coccidios; los recuentos de estos últimos fueron bajos (180 y 240 opg).Con respecto a E. coli, los porcentajes de positividad en MF para los diferentes genes de virulencia fueron: Pap 85% (11/13); Eae 77% (10/13); F17 92% (12/13); CS31A 61,5% (8/13) y Afa-VIII 46% (6/13). Los mismos pertenecen a los patotipos ExPEC y EPEC atípicos. No se identificaron los patotipos ETEC ni STEC. La mayoría de los terneros presentaron infecciones por dos o más de los enteropatógenos mencionados, afectando tanto a terneros con o sin FTP. Todas las muestras de MF fueron negativas a CoVB y Salmonella spp.Discusión: Durante el presente estudio se pudo determinar que la diarrea estuvo asociada a diferentes agentes etiológicos, entre ellos RVB-A, Cryptosporidium, ExPEC (F17, Pap, Afa-VIII, CS31A) y probablemente EPEC atípicos (Eae). El porcentaje de terneros que presentaron FTP coincide con lo reportado en tambos de EEUU. Asimismo, la FTP podría ser uno de los factores predisponentes para estas infecciones.Si bien en Argentina el genotipo G6(IV)P[5] de RVB-A predomina ampliamente en terneros de cría para carne con diarrea, coincidentemente este genotipo fue el único que circuló durante el brote en el tambo. En India, Brazil, USA y España se han identificado EPEC atípicos (Eae+; Bfp-) en terneros diarreicos y en animales sin diarrea. El gen eae codifica para una proteína de membrana, intimina, la cual está implicada en las lesiones de adherencia y borrado (A/E) del enterocito. Si bien las reproducciones experimentales de diarrea o disentería en terneros sólo han sido realizadas con cepas STEC o EHEC bovinas, las EPEC atípicas comparten la capacidad de producir la lesión de A/E. Es interesante destacar que muchos aislamientos de cepas EPEC de terneros presentan subtipos de intimina que son característicos de las EPEC humanas que afectan a niños y adultos, considerándolas un riesgo para la salud pública. En cuanto al patotipo ExPEC en bovinos, la diversidad de factores de virulencia es amplia. Las fimbrias Pap y F17, como así también las adhesinas afimbriales CS31A y Afa-VIII, son factores de colonización que se identifican en cepas aisladas de materia fecal y órganos de terneros con diarrea y septicemia.Finalmente, se podría pensar que el porcentaje elevado de mortandad (41%) durante la crianza podría estar asociado a septicemia por E. coli del patotipo ExPEC ya que el mismo predominó en la MF de los animales estudiados. La FTP y las infecciones concurrentes por RVB-A, Cryptosporidium y posiblemente por EPEC atípicos aumentan la susceptibilidad de los terneros a la sepsis por E. coli (ExPEC). Esto se ha demostrado en diferentes estudios, los cuales indican que el número de E. coli se eleva 5 a 10000 veces en el intestino delgado, independientemente de la etiología de la diarrea; además se estima que el 30% de los terneros con enfermedad severa y diarrea presentan bacteriemia.BibliografíaConstable, P.D. 2004. Antimicrobial Use in the Treatment of Calf Diarrhea. J. Vet. Intern. Med. 18:8:17.