Los intrones del Grupo II como Intermediarios en la Formación de Cassettes de Resistencia a Antimicrobianos

CECILIA QUIROGA; PAUL H. ROY; DANIELA CENTRÓN

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XVII Congreso Latinoamericano de Microbiología. X Congreso Argentina de Microbiología.; 2004

Presentación Oral, se adjunta archivo powerpoint. Los intrones del grupo II como intermediarios en la FORMACIÓN de cassettes de resistencia a antimicrobianos Los cassettes de resistencia a antibióticos son elementos móviles del genoma formados por un gen estructural carente de región reguladora y una región palindrómica de 60 a 140 pares de bases (pb) o sitio de recombinación attC. Se los puede encontrar insertados en la región variable de los integrones mediante una recombinación sitio especifica con la integrasa, una tirosina recombinasa. La integrasa reconoce la estructura secundaria formada por el heptámero GTTPuPuPuPy y su sitio inverso CAAPyPyPyPu, integrando y escindiendo cassettes mediante los cruces attI (en la región 5’CS) x attC (en el cassette) y attC x attC, respectivamente. El análisis estructural de los genes y sus attC demuestra que han evolucionado separadamente. Nosotros hemos encontrado un intrón del grupo II (GII) dentro de un integron de Clase 1 de Serratia marcescens insertado en el punto exacto de unión entre el gen estructural y su sitio attC, TA/ACAA. Se han descripto otros intrones del GII insertados dentro de cassettes de resistencia a antibióticos en Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Vibrio cholerae y Pseudomonas putida. Además, se han encontrado copias independientes de un gen estructural asociado a un intrón de GII y un sitio attC asociado a otra copia del mismo intrón del GII en el cromosoma de Nitrosomonas europaea. El objetivo de este trabajo es demostrar que los intrones del GII están involucrados en la formación de los cassettes de resistencia mediante un mecanismo de “retrohoming” o inserción ectópica, involucrando la recombinación homologa de dos copias del intrón, asociadas independientemente a un gen estructural y un attC, la capacidad de splicing del intrón y su actividad de transcriptasa reversa. Se realizo la co-transformación de dos plásmidos, (plásmido donante: intrón+ y plásmido recipiente: intron-)  dentro de E.coli DH5a (RecA+)  y E.coli JM109 (RecA-). Se comprobó la inserción del intrón del GII dentro de 11 sitios blancos conteniendo diferentes arreglos de cassettes de resistencia en el plásmido recipiente mediante una amplificación por PCR (polimerase chain reaction) con cebadores localizados en el intrón y en el plásmido con la región blanco, respectivamente. Además, se comprobó la capacidad del intrón de producir “self-splicing” mediante la técnica de trascripción in vitro del ADN del intrón con sus exones, seguido por la exposición del ARN resultante a condiciones de Mg2+ y NH4+ convenientes para la autoescisión óptima del intrón y en condiciones mínimas de “splicing”, y, finalmente, la técnica de transcriptasa reversa seguida por PCR (RT-PCR) para visualizar el “splicing”. Se comprobó que el intrón Smtr es capaz de reconocer el sitio exacto de unión entre el gen estructural y el sitio de recombinación attC, TA/ACAA. El intrón Smtr es capaz de reconocer diversas regiones asociadas a los genes estructurales y a los sitios de recombinación attC. Se demostró la capacidad del intrón Smtr de conducir al splicing en condiciones óptimas de 50mM Mg2+ y 500mM de amonio y con una concentración mínima de 5mM de Mg2+.