Adaptación de técnica cromatográfica para el aislamiento de serinoproteasas en columnas de afinidad

LAURA LEIVA; OFELIA ACOSTA; SILVANA MARUÑAK; RAQUEL RUÍZ; NOEMÍ FIDANZA; MARÍA ELISA PEICHOTO; CAROLINA GAY

Resistencia (Argentina)

Otro; Comunicaciones Científicas y Tecnológicas de la UNNE 2002; 2002

Secretaría General de Ciencia y Técnica de la UNNE

Los venenos de serpientes del género Crotalus y Bothrops provocan, entre otras, alteraciones de la hemostasia en el individuo inoculado. Las sustancias responsables de este efecto son enzimas del tipo trombinas que actúan sobre el fibrinógeno convirtiéndolo en fibrina. Estructuralmente pertenecen a la familia de las serinoproteasas, al que también pertenecen la tripsina, la quimotripsina, la elastasa. Un modo de aislarlas desde el material biológico de origen es emplear, en la etapa final de la purificación, columnas de afinidad donde la molécula inmovilizada es p-aminobenzamidina. Las serinoproteasas se fijan específicamente a la matriz de la columna para luego ser eluídas mediante un buffer apropiado. La técnica convencionalmente usada es la elusión con buffer Tris-HCl, pH 9.0, NaCl 400 mM, Benzamidina 150 mM. El inconveniente de esta metodología es la imposibilidad de seguir la elusión de las proteínas mediante lectura espectrofotométrica de absorbancia a 280 nm, a la vez que la enzima es eluída conjuntamente con la benzamidina fijada a su estructura. Dado que ésta es un inhibidor de la enzima, no puede medirse inmediatamente su actividad, debiendo para tal fin eliminar previamente dicho inhibidor. En este trabajo se presenta una variante a esta técnica, y consiste en fluir la enzima fijada a la columna de afinidad, a través de un buffer acetato de sodio a pH 5.0. En este caso, son las cargas de los grupos intervinientes en el proceso de fijación las que son modificadas por el pH y provocan la elusión de la serinoproteasa de la columna. El método se utilizó para la purificación de una enzima tipo trombina presente en el veneno de Crotalus durissus terrificus de la región nordeste de Argentina. Para la técnica se empleó una columna de Benzamidina-Sepharose 6 B, estabilizada con buffer Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.4 M, pH 9.0. Se sembró el extracto conteniendo la enzima ofídica parcialmente purificada, obtenida de la separación cromatográfica por columna de Sephadex-G75, empleándose el mismo buffer para la elución de las proteínas no fijadas, y a la vez, permitiendo la fijación de la enzima de interés. La detección de proteínas se realizó por absorbancia a 280 nm. Luego de volver la lectura a la línea de base, se cambió el buffer por acetato de sodio 0.1 M, NaCl 0.3 M, pH 5.0. La enzima de interés (enzima tipo trombina) eluyó en esta etapa, y su presencia se detectó a través de su acción coagulante sobre plasma libre de plaquetas. La variante introducida en esta técnica posibilita un fácil seguimiento de la elusión proteica sin consumo de muestra, como sí implica, por ejemplo, empleo de Coomassie Blue como colorante para detección de proteínas. Finalmente, la enzima es eluída en su forma biológicamente activa, lo que permite su inmediata detección sin necesidad de agregar otra etapa de purificación, con la concomitante pérdida cuantitativa de la enzima.