Estudios funcionales de proteasas y sus substratos durante el proceso de invasión de las células huésped por Toxoplasma gondii

FABIOLA PARUSSINI; QING TANG; SYED M. MOIN; JEFFREY MITAL; SINISA URBAN; GARY E. WARD

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXVII Reunión Anual; 2015

Sociedad Argentina de Protozoología

Los apicomplexas son un grupo deparásitos protistas, algunos de los cuales tienen significancia médica yveterinaria, tales como Plasmodium sp.,Toxoplasma, y Cryptosporidium. El proceso de invasión de la célula huésped porlos parásitos apicomplexas comprende múltiples pasos que incluyen: movilidaddependiente de substrato, asociacióndébil seguida por una uniónadherente con la célula huésped, reorientación del polo apical del parásitohacia la superficie de la célula huésped, descarga del contenido de organelassecretorias, formación de una uniónfuerte y estrecha entre las membranas plasmáticas del parásito y la célulahuesped, y penetración del parásito en el interior de la célula huésped. Uncomponente clave de la maquinaria de invasión es el Antígeno 1 de MembranaApical (AMA1), una proteína integral de membrana con topología tipo I que seconserva en el Phylum Apicomplexa. La proteína AMA1 de Toxoplasma gondii (TgAMA1), durante el proceso de invasión de lacélula huésped, se secreta sobre la superficie del parásito, y su ectodominioposteriormente es liberado por un clivaje proteolítico en su segmentotransmembrana. Para elucidar la función de la proteólisis intramembrana deTgAMA1, usamos un ensayo de actividad reconstituido en células COS para caracterizar losdeterminantes en la secuencia de aminoácidos del segmento transmembrana deTgAMA1 (ALIAGLAVGGVLLLALLGGGCYFA) que gobiernan su procesamientoproteolítico mediado por proteasas Romboides (ROM). Los análisis cuantitativosde actividad revelaron que la mutación TgAMA1L/G estimuló elclivaje, que fue 13 veces mayor que TgAMA1WT. En contraposición, lamutación TgAMA1AG/FF redujo 30 veces el procesamiento, mientras quela mutación TgAMA1GG/FF tuvo un efecto minoritario en el mismo, y lamutación de ambos motivos TgAMA1AG/FF+GG/FF bloqueó completamente elprocesamiento. Luego, complementamos una línea de parásitos TgAMA1KD(KD: knockdown condicional) con plásmidos que expresan estas variantes de laproteína TgAMA1. Contrario a lo esperado, las mutantes que incrementan odisminuyen el procesamiento de TgAMA1 por más de 10 veces no provocaronconsecuencias fenotípicas, lo cual reveló que los niveles de proteólisisdependiente de proteasa Romboides en los parásitos no están altamenteregulados. Sólo, parásitos transgénicos que expresan o contienen en sus genomasun alelo de la mutante no clivable TgAMA1AG/FF+GG/FF presentó uncrecimiento defectuoso, que es el resultado de una eficiencia reducida deinvasión de la célula huésped, sin la perturbación de la replicaciónintracelular. Estos datos demuestran que el procesamiento intramembrana deTgAMA1 desempeña un rol en la invasión, pero refuta un modelo propuesto enforma reciente en el cual la replicación intracelular del parásito es reguladapor el procesamiento intramembrana de TgAMA1 mediado por TgROM4.