Segundo Informe Proyecto PRASY: PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DE EXTRACTOS DE Ilex paraguariensis St. Hil. (YERBA MATE) SOBRE BACTERIAS RESISTENTES

LACZESKI M.; NOVOSAK, M.; WINNIK, D.; ONETTO, A.

2019-08-26/2020-11-02

Biológica

Salud humana

Las bacterias multirresistentes se asocian a infecciones nosocomiales y adquiridas en la comunidad, siendo una de las principales amenazas de salud pública del siglo XXI. De no controlarse su propagación, estas bacterias podrían volverse más letales de lo que son actualmente. Por esto, la Organización Mundial de la Salud publicó una lista de prioridades para desarrollar tratamientos antibióticos nuevos y eficaces. La yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) es una especie vegetal con actividad antimicrobiana, por lo que constituye una opción adecuada para el estudio de su actividad frente a bacterias portadoras de mecanismos de resistencia. El objetivo fue identificar las fracciones con actividad antibacteriana de extractos de yerba mate sobre bacterias portadoras de mecanismos de resistencia a antibióticos.Se recolectaron hojas de I. paraguariensis (Fundación Alberto Roth, Santo Pipó, Misiones). Estas se escaldaron (100 °C, 30 seg) y se enfriaron rápidamente en agua y se aplicaron diferentes tratamientos térmicos: Sin tratamiento (Tamb), 50°C-30?, 50°C-60?, 80°C-30? y 80°C-60?. Una vez secas se molieron en molino tipo Wiley. Se obtuvieron extractos por digestión en solución hidroetanólica al 96%, concentrándose en un evaporador rotatorio. Se evaluó la Dosis Inhibitoria Mínima (DIM) por el método de Kirby-Bauer modificado. Los extractos se suspendieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y se aplicaron a discos de papel de filtro (6mm) obteniéndose cargas efectivas de 8; 4; 2; 1; 0,75; 0,5 y 0,25mg. Como controles positivos se emplearon discos de antibióticos comerciales y como control negativo se emplearon discos con DMSO. Se evaluaron cepas patrones y clínicas con mecanismos de resistencia. La separación de los compuestos bioactivos de los extractos, la determinación del factor de retención (Rf) y la identificación preliminar del grupo de metabolitos secundarios al que pertenecen se realizó con cromatografía en capa fina (TLC) y bioautografía. La obtención de fracciones más puras de los extractos se llevó a cabo a través de la partición parcial con mezclas de solventes en orden creciente de polaridad: Cloroformo ? metanol y Acetato de etilo - Acido fórmico ? ácido acético - agua. La cepa de referencia Staphylococcus aureus meticilino resistente (SAMR) ATCC 43300 se utilizó para los ensayos de bioautografía. Se puso a punto la técnica de TLC y se eligió el sistema de solventes con el que se obtuvo mejor separación: cloroformo - metanol (8:2) V/V. Las placas cromatográficas se revelaron a la luz UV (254 nm y 365 nm) y con reactivo para productos naturales (RPN). Se determinó la presencia de sinergismo al enfrentar el extracto alcohólico frente a antibióticos de uso clínico usando el Test del doble disco, según protocolo descripto por (Sachdeva & Sharma, 2017). Se observó que los extractos de yerba mate alcohólico presentaron actividad antibacteriana sobre Staphylococcus aureus ATCC® 43300? y Providencia rettgeri metallo-β-lactamase (MBLs); así como a 9 de 10 cepas clínicas de SARM y 1 de 10 cepas clínicas productoras de carbapenemasas. A partir de los dos métodos de bioautografía ensayados, por contacto ydirecta, se seleccionó la bioautografía por contacto ya que permitió la observación a simple vista de las zonas de inhibición del desarrollo de SARM. Los análisis de TLC y bioautografía mostraron actividad antibacteriana del extracto etanólico a temperatura ambiente frente a SAMR ATCC 43300 en valores de Rf de 0,16. Esta actividad podría atribuirse a compuestos pertenecientes al grupo de los flavonoides los cuales revelaron de color amarillo - verde fluor en las placas de TLC. Se evidenció sinergia entre los halos de inhibición de los discos de extracto de yerba mate tratados a temperatura ambiente y Cefoxitina (30µg) y el extracto 80°C 30 min y clindamicina (2 μg) sobre Staphylococcus aureus ATCC 43300. Los extractos de yerba mate 50°C 30 min, 50°C 60 min y 80°C 30 min y Meropenem (10 ug); el extracto de yerba mate 50°C 30 min y Imipenem (10 ug) y extracto de yerba mate 50°C 60 min y Cefotaxima (30 ug) producen acción sinérgica sobre Klebsiella pneumoniae ATCC 700 603. Los hallazgos de este estudio muestran que la actividad antibacteriana de los extractos etanólico de las hojas de I. paraguariensis sobre SARM se encuentra en fracciones específicas. En este sentido se amplía el conocimiento de esta planta como una fuente de metabolitos activos con actividad antimicrobiana que pueden integrar formulaciones farmacéuticas futuras, agregando valor al producto.