Sistema cactus-levadura-Drosophila: censo de la biodiversidad de organismos saprobios en tejidos en descomposición de cactáceas simpátricas

MONGIARDINO KOCH, N.; SOTO, I.; GALVAGNO, M.A.; IANNONE L.J.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Micología; 2014

Asociación Argentina de Micología

Sistema cactus-levadura -Drosophila: censo de la biodiversidad de organismos saprobios en tejidos en descomposición de cactáceas simpátricas Mongiardino Koch N.1, Soto I.1, Galvagno M.2 y Iannone L. Lugar: 1Instituto de Ecología, Genética y Evolución (CONICET), Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Argentina. 2 Departamento de Ingeniería Química-Facultad de Ingeniería-UBA e IIB-CONICET. 3 PROPLAME-PRHIDEB-CONICET-Depto. Biodiversidad y Biología Experimental-FCEyN-UBA. Introducción: Los cactus son elementos claves en la dinámica ecológica de los desiertos, debido en parte a su capacidad de almacenar grandes cantidades de agua y de mantener una eficiencia energética elevada en climas áridos. Asimismo, sus tejidos necróticos representan nichos extremadamente ricos, y albergan consecuentemente una gran diversidad de artrópodos y organismos saprobios. Una de las interacciones ecológicas más estudiadas que se desarrollan en los tejidos necróticos de cactáceas a lo largo de todo el continente americano es el denominado sistema cactus-levadura-Drosophila. Del mismo participan especies cactófilas del género Drosophila, las cuales utilizan cactus columnares y opuntias como sitios exclusivos de oviposición y alimentación. Las larvas de estos organismos se desarrollan en el cactus, alimentándose del mismo y de la diversidad de microorganismos presentes. Al emerger luego de la metamorfosis, las moscas acarrean consigo una muestra de esta microflora saprobia, en especial un subconjunto de organismos unicelulares que se conocen como levaduras cactófilas. Por lo tanto, la interacción entre levaduras y moscas es de tipo mutualista: la levadura utiliza a la mosca como vector, logrando así dispersar a nichos dispersos y efímeros; mientras que la mosca inocula en el sitio de oviposición un conjunto de organismos que garantizan el avance de la necrosis, y sirven como alimento directo para su progenie. Este sistema fue central en las primeras etapas de la ecología microbiana como disciplina, y por tanto ha sido extensamente estudiado en los desiertos de América del Norte y Australia. La estructura y composición de la comunidad de levaduras cactófilas depende de múltiples factores, entre los cuales se considera como principales a la química del cactus hospedador y el comportamiento del organismo vector. Es por lo tanto de esperar que el estudio de los sistemas análogos que se desarrollan en las zonas desérticas de América del Sur, hábitat de especies autóctonas de cactus y moscas cactófilas, brinde información única y novedosa acerca de la diversidad y la ecología de las levaduras saprófitas. En particular, una cualidad única de las especies cactófilas de Drosophila preponderantes en las zonas desérticas del centro-norte de Argentina (D. buzzatii y D. koepferae), es el hecho de presentar un uso compartido de recursos. Es decir que, si bien ambas especies presentan una cierta preferencia por un sustrato en particular, ambas emergen tanto de necrosis de Opuntia como de cactus columnares. Esta es una diferencia de suma importancia con respecto a lo que ocurre en los desiertos de Sonora y Arizona por ejemplo, en los que cada especie de mosca explota exclusivamente una especie de cactus. Asimismo, se sabe que las especies de cactus presentes en las regiones áridas del NOA difieren en su composición nutricional, siendo los cactus columnares más ricos en ácidos grasos de cadena media, los cuales pueden inhibir el crecimiento de ciertas especies de levaduras. Objetivos: Aislar y caracterizar las especies de hongos y microorganismos afines saprobios presentes en descomposiciones simpátricas de Opuntia sulphurea autor y Trichocereus terscheckii autor. Determinar la frecuencia y abundancia de cada especie en las muestras de cada cactus. Estudiar el patrón de diversidad observado y relacionarlo a las cualidades de los vectores y hospedadores presentes en la región. Materiales y métodos: Se recolectaron asépticamente 9 muestras de tejidos necróticos de T. terscheckii y 11 de O. sulphurea, todas ellas dentro de la Reserva Natural Valle Fértil, San Juan. Las mismas fueron luego trasladadas en condiciones refrigeradas hasta el laboratorio. Se colocó 1 g de cada muestra en un Erlenmeyer con 20 ml de solución salina, y se lo incubó por agitación durante 48 hs a 24 ºC. La suspensión resultante fue diluida serialmente y sembrada por triplicado placas de Petri con agar Sabouraud con el agregado de Cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano. Las cajas de Petri fueron incubadas a 24 ºC, e inspeccionadas a las 48 y 96 hs. Se seleccionaron aislamientos representantes de todos los morfotipos encontrados, los cuales fueron caracterizados según su morfología colonial y celular y conservados en tubos pico de flauta a 4ºC Asimismo, se contó el número de colonias por morfotipo de forma tal de estimar la concentración de UFC en las muestras originales. Cada morfotipo fue a su vez caracterizado fisiológicamente empleando el kit API C Aux (Biomerieux) para establecer la capacidad de cada cepa de asimilar 19 fuentes distintas de carbono. A su vez uno o dos aislamientos de cada morfotipo fueron caracterizados mediante el análisis de secuencias del dominio D1/D2 de la subunidad mayor del ADN ribosomal. Para esto se extrajo ADN genómico utilizando el kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM (Zymo Research) a partir de aproximadamente 100 mg de células de cada morfotipo crecido durante 24hs en caldo Sabouraud. Posteriormente, se amplificó mediante PCR el dominio D1/D2, mediante el uso de los primers universales para hongos NL-1 y NL-4. Los productos fueron secuenciados y comparados contra bases de datos genéticos mediante el uso del software BLAST (NCBI). Las cepas fueron asignadas a especies ya descriptas en caso de encontrarse secuencias con un grado de similitud ≥ 98% (límite máximo considerado como polimorfismo intraespecífico). La asignación fue a su vez confirmada corriendo una filogenia por máxima verosimilitud con el software MEGA 5.2, incluyendo las secuencias obtenidas y la de cepas tipo con alto grado de semejanza. Dada la riqueza de la necrosis como nicho, es altamente probable aislar especies resultantes de eventos de infección accidental, sin por eso estar dichos organismos involucrados en relaciones ecológicas intrínsecas al sistema. Por lo tanto, se definieron ciertos criterios para diferenciar organismos cactófilos de saprobios ocasionale, con base en: a a) La frecuencia de muestras positivas, b) la densidad de UFC por muestra, y c) la asociación a cactáceas en otras áreas de estudio. Sólo especies que cumplieron dichos criterios fueron considerados como componentes de la comunidad de levaduras cactófilas de la región de estudio. Resultados: Se identificaron 14 especies de organismos descomponedores en las 20 muestras analizadas. De éstas, 13 fueron hongos, con una preponderancia de especies del phylum Ascomycota (85%), mientras que una resultó ser un alga verde del género Prototheca. Trece especies pudieron ser identificadas a nivel específico, mientras que una cepa -tentativamente asignada al género Rhodotorula- mostró un nivel de similitud bajo con las secuencias disponibles en las bases de datos, y posiblemente represente una especie nueva. Entre las especies aisladas, seis fueron encontradas en frecuencias y concentraciones bajas (5-10% de muestras positivas, < 20 UFC por mg de tejido fresco). Estas especies fueron: Fusarium oxysporum, Phoma opuntiae, un miembro del complejo críptico Fusarium equiseti-incarnatum, Magnusiomyces ingens, Magnusiomyces capitatus y Rhodotorula sp. Un análisis bibliográfico permitió asociar dichas especies a hábitos de tipo fitopatógeno, endofito y morador de suelos, árboles o frutos. Se circunscribió de tal forma la comunidad cactófila de Valle Fértil a ocho especies que estuvieron presentes en un número mayor de muestras y en densidades consistentemente más elevadas. Seis de ellas, Pichia cactophila, Sporopachydermia cereana ´australis´, Fusarium lunatum, Prototheca zopfii, Cryptococcus terrestris y Tortispora phaffi. habían sido consideradas ya como organismos cactófilos en otras regiones estudiadas. Mientras que C. terrestris y F. lunatum aparentan ser componentes autóctonos de la comunidad en la región bajo estudio. La riqueza general a nivel específico de las necrosis de Opuntia sulphurea fue levemente superior a la encontrada para necrosis de Trichocereus terscheckii (2,36 ± 1,75 vs. 1,89 ± 0,93). Cuatro especies (F. lunatum, Pr. zopfii, Pi. cactophila y Dipodascus. australiensis) fueron encontradas en ambos recursos, y representaron el 73% de todos los aislamientos. T. phaffi fue encontrada exclusivamente en Trichocereus, y las restantes 3 especies fueron aisladas tan sólo a partir de muestras de Opuntia. Conclusiones: La comunidad de organismos saprobios cactófilos en la localidad de Valle Fértil presenta múltiples semejanzas con respecto a las comunidades estudiadas de América del Norte, así como un cierto número de particularidades únicas. En primer lugar, se comprobó la presencia de Pi. cactophila, S. cereana y Pr. zopfii, tres especies recurrentemente aisladas en todas las localidades estudiadas hasta la fecha. Otras tres especies, M. spicifer, Di. australiensis y T. phaffi, si bien han sido previamente aisladas a partir de necrosis en distintas regiones, son considerados organismos menos comunes, explotando tan sólo tejidos en descomposición de ciertas especies de cactus. De hecho, ésta es la primera vez que se recupera a Di. australiensis a partir de un cactus columnar. Por otra parte, la especie Cryptococcus terrestris fue recientemente descripta a partir de ciertos casos de criptococósis en Brasil. Ésta es la primera vez que se demuestra su asociación a cactáceas, ya que se carecía hasta la fecha de información ecológica relevante. Asimismo, éste representa el primer reporte de esta especie potencialmente patógena para el territorio argentino. En contraposición, Fusarium lunatum es un hongo fitopatógeno, implicado como agente causante de la "mancha negra del nopal". A pesar de conocerse su presencia en cactus en descomposición, esta es la primera vez que es aislado en estudios relacionados al sistema cactus-levadura-Drosophila. De hecho, es la primera vez que un hongo filamentoso es considerado como miembro de una comunidad cactófila. Sin embargo, tanto su frecuencia como su densidad en muestras positivas muestran la preponderancia de esta especie en necrosis utilizadas por moscas cactófilas, y su elevado poder de penetración en tejidos verdes, junto con su gran capacidad fermentativa (cuyos productos son utilizados como señales olfativas por las moscas) permiten postular que esta especie probablemente juegue un rol central en la dinámica ecológica de esta comunidad. La discusión acerca de si son los fenómenos dispersivos o las restricciones químicas los factores principales que determinan la presencia de una especie saprófita en una dada necrosis aún carece de una respuestas definitivas. Sin embargo, la constitución particular del sistema presente en Valle Fértil, con dos especies de vectores generalistas que explotan hospedadores químicamente diferenciados y en simpatría, permite identificar los procesos de mayor relevancia a partir del patrón observado de presencia/ausencia para cada saprobio. En concreto, se observa que 4 especies explotan ambos recursos, mientras que 3 son halladas exclusivamente en Opuntia. La especie restante, T. phaffi, fue aislada de una única muestra de T. tersheckii. Sin embargo, éste es un organismo muy poco frecuente, cuyocepa tipo se obtuvo de una muestra necrótica de Opuntia en Tucumán. Es por tanto más plausible que esta especie se encuentre presente en ambos recursos, y que su aislamiento a partir de un cactus columnar se deba a su baja abundancia. De tal forma se puede ver como la comunidad de microorganismos presentes en las necrosis de Trichocereus representa un subconjunto de la comunidad presente en Opuntia. Este patrón anidado de biodiversidad no había sigo registrado hasta la fecha en ningún otra área de estudio. Proponemos que las causas de este patrón son: 1) El uso compartido de recursos por los vectores que garantiza un transporte constante de microorganismos y una homogeinización inicial de las comunidades; 2) Una selección subsecuente de los organismos resistentes a la química compleja de los cactus columnares, resultante en sólo un subconjunto de especies prosperando en las necrosis de Trichocereus. Estudios posteriores sobre capacidad de las moscas para transportar a los microorganismos identificados y la resistencia de los mismos a los acidos grasos presentes en cada cactus permitirá evaluar estas hipótesis.