Clonado y estudio de la expresión del gen guaB de Rhizobium tropici CIAT 899

COLLAVINO, M. M. Y AGUILAR, O. M.

Viña del Mar, Chile

Congreso; Reunión Iberoamericana de Bioquímica, Biología Molecular y Biología Celular; 2000

En este trabajo se estudia al mutante R. tropici CIAT899-10.T (guaB-) afectado en su tolerancia térmica y capacidad de nodular eficientemente P. vulgaris. La mutación mapea en el gen guaB (enzima inosina monofosfato deshidrogenasa) de síntesis de novo de las purinas. Previamente demostramos que R. tropici usa xantina oxidasa como vía alternativa. El mutante no es auxótrofo para guanina.  Con el objeto de examinar la organización y regulación del gen guaB se clonó la región respectiva como un fragmento EcoRI de 8.0 Kb a partir de una mini biblioteca y se usó para complementar fenotipicamente al mutante. Además se clonó un fragmento PCR que comprende el ORF de guaB en el vector pSUP204 resultando en una expresión iniciada en el promotor de cloramfenicol del vector. Ambos plasmidos fueron transferidos a las cepas salvaje CIAT 899 y  mutante CIAT 899-10.T. Se observó que los plásmidos con el gen guaB restauran la tolerancia a altas temperaturas. Asimismo la cepa mutante que contiene los plásmidos no resultan inhibidas con allopurinol, lo que demuestra el uso de la vía que comprende la IMPd. Por otra parte, los resultados negativos de amplificación con primers específicos para el gen guaA usando el fragmento de 8.0 Kb EcoRI (guaB) indicarían que a diferencia de E. coli,  los genes guaA no estarían agrupados en R. tropici. Ensayos de expresión del gen guaB fusionado al reportero lacZ indicarían que el gen está activado en el mutante defectivo de IMPd probablemente por acumulación de substrato, y  es reprimido por el producto final guanina.