Actividad de beta;-galactosidasa en ambientes superpoblados

LEDESMA, DARIO; PERILLO, MARÍA ANGÉLICA; NOLAN, MARÍA VERÓNICA

San Juan

Congreso; Segunda Reunión Conjunta de Sociedades de Biología de la República Argentina; 2011

Sociedad de Biología de Córdoba-Sociedad de Biología de Cuyo-Sociedad Argentina de Biología

Actividad de β-galactosidasa en ambientes superpoblados Dario Ledesma, María A Perillo, y Verónica Nolan.* Cátedra de Química Biológica,,Dpto. Química e Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA). Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Unidversidad Nacional de Córdoba, Argentina e-mail: vnolan@efn.uncor.edu   El citoplasma celular contiene una gran diversidad de especies químicas donde las macromoléculas ocupan una gran fracción del volumen total generando un ambiente superpoblado (AS). En estas condiciones alejadas de la idealidad aparecen restricciones estéricas y difusionales que afectan las velocidades de reacciones bioquímicas de una manera compleja cuyo resultado dependerá de la naturaleza de cada reacción y cuya comprensión presenta numerosos desafíos teóricos y metodológicos. La espectrofotometría (EF) es la técnica de elección para caracterizar la cinética de aparición de producto en reacciones catalizadas por enzimas. Sin embargo, la  aplicación de EF en AS presenta dificultades debidas a fenómenos interfasiales y/o de heterogeneidades en la viscosidad que introducen interferencias ópticas. Estas últimas estarían ausentes en técnicas como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC, Isothermal Titration Calorimetry) donde se mide el flujo de calor asociado con una reacción química. Además, dado que prácticamente todas las reacciones químicas trancurren con toma o liberación de calor, la ITC encontraría una amplia aplicación.. El objetivo del presente trabajo fue investigar, por medio de la técnica de ITC, el efecto de la superpoblación macromolecular sobre la cinética y la termodinámica de hidrólisis de o-nitrofenil galactopiranósido (ONPG) catalizada por beta-galactosidasa de E.coli (b-Gal). La condición de AS se simuló con disoluciones de polietilenglicol PM 6000 (PEG6000) a distintas concentraciones (0 a 15 %). La actividad enzimática se estudió tanto por EF como por  ITC. En presencia de [PEG6000] ≤ 15 % P/V, ambas técnicas arrojaron resultados similares para los parámetros cinéticos de la reacción estudiada. A mayores concentraciones de PEG6000 los datos de ITC, pero no los de EF, exhibieron una dispersión tan elevada que impidió el ajuste de las curvas.. En el AS la Vmax se mantuvo constante, mientras que la KM aumentó desde 0,14 mM a 1mM a 0% y 35% P/V PEG6000, respectivamente. Esta disminución en la afinidad se debería a impedimentos difusionales que impone la superpoblación. ITC detectaría efectos termodinámicos concomitantes que requerirán estudios complementarios.     Tópico Temático: Biofísica (BF)   b-Galactosidasa, cinética enzimática, superpoblación molecular, Calorimetría de titulación isotérmica