Bioactividad de Beta-Galactosidasa en un ambiente que simula la superpoblación molecular de los alimentos y del quimo

MARÍA VERÓNICA NOLAN, JULIETA MARÍA SÁNCHEZ Y MARÍA ANGÉLICA PERILLO

Cordoba

Congreso; III Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los alimentos; 2009

Ministerio de Ciencia y Tecnología de Cordoba

En nuestro laboratorio estamos interesados en el desarrollo de una formulación oral conteniendo la enzima beta-galactosidasa (beta-Gal) para ser aplicada, usando alimentos como vehículo,  como terapia de sustitución enzimática en al tratamiento de la hipolactasia. Esto implica el desafío de identificar las bases físico-químicas potenciales que explican el efecto de los sistemas biológicos que constituyen alimentos como tales o como elementos activos en la biotecnología de alimentos, sobre la biodisponibilidad y la actividad del fármaco, que en este caso es la enzima. Para esto es necesario considerar que la mayoría de las formulaciones alimenticias y también el quimo (la masa de alimentos digeridos que se transporta a lo largo del aparato digestivo) son sistemas molecularmente muy concentrados. Debido a la superpoblación molecular la actividad termodinámica del agua es notablemente baja respecto a la del agua libre. En estas condiciones, se espera que los efectos del volumen excluido afecten la velocidad de difusión de solutos y en consecuencia la cinética de las reacciones químicas que ocurren en ellos. Además, en los sistemas molecularmente superpoblados la termodinámica del agua difiere de la del agua libre, por lo cual se puede ver afectado el efecto hidrofóbico que participa en el plegamiento de las proteínas. Un modelo para estudiar este tipo de ambientes son las sustancias poliméricas hidrofílicas de alto peso molecular tales como el polietilenglicol (PEG). El objetivo del presente trabajo fue evaluar si la superpoblación molecular inducida por PEG 6000, por medio de sus efectos sobre la termodinámica del solvente, es capaz de modular la actividad enzimática y la estabilidad conformacional de la beta-Gal de Escherichia coli.             Se evaluó la variación de la velocidad de hidrólisis de un sustrato artificial (orto-nitrofenilgalactopiranósido, ONPG) a concentraciones 0-3 mM ONPG, en presencia de PEG6000 (entre 0 y 25%P/V). Las muestras se incubaron a 37ºC durante 15 min. La reacción se detuvo por medio del agregado de NaOH 0.1 M (concentración final) y una incubación a 100ºC durante 10 min. El sólo cambio de pH no fue suficiente para inactivar la enzima. Por otra parte, el Na2CO3, usado tradicionalmente como inactivador en este tipo de ensayos, fue reemplazado por NaOH para prevenir la separación de fases liquído-líquido inducida por PEG. La reacción mostró una cinética michaeliana a todas las concentraciones de PEG. Ambos parámetros cinéticos (KM y Vmax) aumentaron a en función de la concentración de PEG pasando de 0.27 mM y 0.54 µmol/min./mg proteína en ausencia de PEG a 0.55 mM y 0.69 µmol/min./mg proteína a [PEG]=25 % P/V. La estabilidad estructural de la proteína se evaluó por medio de la calorimetría diferencial de barrido (DSC). La proteína en agua mostró un equilibrio de desplegamiento con dos dominios calorimétrico (Tm 46,4°C y 53,4°C). A medida que aumenta la concentración de PEG, se observa que el primer pico en agua se desplaza un grado hacia la derecha y que su entalpía disminuye marcadamente hasta desaparecer a PEG 35%P/V. El segundo pico, aparece a una temperatura que a no cambia hasta alcanzar una concentración de PEG de 35% P/V donde se observa una diferencia de +0.8oC respecto al control. En presencia de PEG aparece un tercer pico que pasa de 56.36 oC a PEG 25 %P/V a 57.18 oC a PEG 35 %P/V y que estaba ausente en el control. La compactación de la estructura de la proteína y la disminución en la hidratación del entorno molecular próximo, podrían generalizarse como los factores responsables del cambio en la estructura que luego se traducen en cambios en la cinética de la reacción catalizada por la b-Gal.