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1) Estudios de biorremediación de suelos contaminados con cadmio por cepas autóctonas de actinomycetes El cadmio es un metal pesado altamente tóxico, de gran movilidad en el suelo y su transferencia a las plantas puede llevar a la acumulación en raíces, tallos, hojas y frutos. En consecuencia la producción de las mismas puede tornarse no apta para consumo animal y humano. La concentración normal de cadmio en suelos es de 0,01 a 4,5 mg kg-1; mientras que en los contaminados asciende hasta 160 mg kg-1. Resultados Ensayo cuantitativo La cepa F4 previamente aislada de sedimentos provenientes de la mina de uranio de Wismut fue capaz de crecer en Medio Mínimo agarizado (MM) adicionado de hasta 150 ppm de Cd en 30 días. En Medio Mínimo líquido esta cepa creció con una concentración de Cd de 15 ppm. El ensayo cuantitativo se realizó en placas de MM agar (L-asparagina 0,5g; K2HPO4 0,5g; MgSO4+7H20 0,2g; FeSO4+7H2O 0,01g; Glucosa 10 g), adicionada de 150 ppm Cd (en forma de solución de CdCl2+2 H20), e incubada durante 30 días a 30°C. En MM líquido, la cepa F4 se incubó a 30°C durante 14 días, y 160 rpm de agitación. Ensayos de adaptación Similares valores de resistencia al Cd se obtuvieron en ensayos comparativos realizados con la cepa F4 con y sin adaptación previa al metal. La cepa F4 preadaptada y no al Cd, fue repicada en placas con MM con una concentración de Cd de hasta 100ppm. En MM líquido la cepa adaptada a 100 ppm Cd y la no adaptada, crecieron hasta 15 ppm Cd en 14 días. Mientras que en el mismo medio pero adicionado de 20 ppm de Cd, ninguna de las dos creció. Ensayos de bioabsorción en suelo. Se puso a punto la técnica de extracción de la fracción biodisponible de cadmio, para la planta en muestras de suelo. Con este método se puede determinar cuanto cadmio es absorbido por la cepa en estudio, Streptomyces F4. Se inocularon muestras de suelo con Cadmio (25ppm) con la cepa Streptomyces F4. Luego de 8 semanas de incubación se determinó que en las muestras inoculadas con F4, la concentración residual de Cd biodisponible fue 0,25 y 0,58 ppm (mg/Kg). La medición del Cd en el sobrenadante se realizó con un espectrómetro de absorción atómica ICP-AES (Inductively Coupled Plasma, Atomic Emision Spectrometer). A partir de los resultados obtenidos se puede inferir que la cepa Streptomyces F4 absorbe la mayor parte del Cd que se encuentra biodisponible en el suelo. Caracterización molecular La caracterización parcial de dicho microorganismo se llevó a cabo mediante la determinación de las secuencias de bases del ADNr 16S. Los cebadores utilizados durante los ensayos de amplificación de secuencias fueron 243 F y A3 R, específicos para actinomycete. Se determinó que la cepa F4 posee una homología de 99% con Streptomyces tendae. El fragmento amplificado fue de 1.250pb, los cebadores utilizados fueron diseñados por Monciardini y col. (2002). Extracción de plásmidos. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de plásmidos en las cepas utilizadas, y si en estos se encontrarían los genes que codifican para la resistencia a metales pesados. Luego de numerosos ensayos en electroforesis en campo pulsado se pudo determinar que la cepa la cepa Streptomyces F4 no posee plásmidos. Tampoco se detectaron plásmidos en las cepas AB0 y MC1 (actinomycetes resistentes al cobre y cromo, respectivamente). Sin embargo se detectaron dos plásmidos de aproximadamente 45 kb y 140 kb en la cepa R22, un Streptomyces altamente resistente al cromo. Estos plásmidos podrían poseer genes de resistencia a este metal. Por lo cual serán empleados en estudios posteriores. Cuando se utilizó el método tradicional de lisis alcalina, no se detectaron plásmidos en Streptomyces F4, pero sí en dos aislamientos Streptomyces provenientes de Ushuaia (aislamientos realizados para la búsqueda de una cepa resistente al Cd). En el caso de Streptomyces F4, al no detectarse plásmidos, es muy probable que los genes responsables de la resistencia al Cd estén situados en el cromosoma. 2) Estudios de biorremediación de suelos contaminados con cobre por cepas autóctonas de actinomycetes Objetivos 1. Caracterización molecular del género de cepas de actinomycetes resistentes a cobre previamente aisladas a partir de muestras de sedimentos contaminados con cobre. 2. Determinación de la acumulación del cobre en las diferentes fracciones subcelulares en la cepa actinomycete AB0. 3. Identificación de proteínas asociadas a cobre, en la fracción citosólica de la cepa AB0 por medio de cromatografía de filtración en gel y espectrofotometría de absorción atómica. 4. Demostración de la capacidad de acumulación de cobre por AB0 usando una técnica histoquímica para microscopía electrónica de transmisión Metodología y Resultados Se realizaron extracciones de ADN total de las cepas previamente aisladas: AB0, AB2A, B y C, AB3, AB5A, B, C, D, E y F (Albarracín et al, 2005) utilizando la técnica descripta anteriormente por Cook and Meyers (2003). Como cepa control se utilizó S. coelicolor. A partir de las muestras de ADN aisladas, se realizaron reacciones de amplificación en un Ciclador Térmico utilizando primers para la amplificación parcial del gen que codifica el16s rRNA. Los productos de amplificación obtenidos fueron visualizados en geles de agarosa y posteriormente utilizados en ensayos de restricción (ARDRA). De tal modo de utilizar la clave descripta por Cook an Meyers (2003) para una rápida identificación de actinomycetes al nivel de género, se eligieron las siguientes enzimas: Kpn I, Ase I, Pst I, Sau3AI y SphI para los ensayos de restricción. Los ensayos de restricción se incubaron durante 12 hs y luego el resultado fue visualizado en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. Los resultados obtenidos permitieron determinar que todas las cepas aisladas de los sedimentos contaminados pertenecen al género Streptomyces. Después de 7 días de incubación de la cepa AB0 en medio de cultivo mínimo suplementado con 0,5 mM de CuSO4 se realizó la técnica descripta por Surowitz y col. (1984) para el fraccionamiento, determinándose posteriormente el cobre acumulado en las distintas fracciones por espectrofotometría de absorción atómica. Los resultados obtenidos permitieron determinar que el cobre se distribuye de la siguiente manera en las subfracciones celulares: Exopolisacárido: 50 %, Citosol: 38 %, Pared Celular: 11 %, y Ribosomas y Membranas: 1, 6 %. La fracción citosólica obtenida previamente fue utilizada para realizar cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-50). Se utilizó como control la fracción citosólica obtenida a partir de un cultivo de la cepa crecida en medio sin cobre. Se obtuvieron así 95 fracciones las que fueron analizadas por su contenido en proteína y cobre. Se observaron dos picos de proteínas asociados a los picos de cobre obtenidos: Primer pico: (asociado a mayor pico de cobre) proteína de mayor peso molecular hasta 66 kDa y segundo pico de menor peso molecular cercano a 25 kDa. La determinación de la acumulación de cobre intracelularmente por microscopía electrónica de transmisión estableció que al utilizar el reactivo de Timm, el Cu++ que se acumuló intracelularmente aparece como una reacción de depósitos de plata reducida dentro de la célula principalmente en las zonas donde se produce el crecimiento apical, sin embargo se encontraron que algunos de estos depósitos estaban asociados al exopolímero producido por la cepa AB0. Por otro lado, se utilizaron técnicas de microtitulación que incluyen resistencia a lisozima y NaCl, producción de melanina, tolerancia la pH y asimilación de carbohidratos para determinar aspectos bioquímicos y morfológicos de la cepa AB0. De acuerdo a los resultados obtenidos y a la secuenciación del 16S rDNA la cepa AB0 fue caracterizada como Amycolaptosis sp. AB0. 3) Determinación de la actividad cromato reductasa de Streptomyces MC1 Objetivos - Estudio la actividad cromato reductasa de Stretptomyces MC1 Metodología y Resultados Se realizó el crecimiento de Streptomyces MC1 en medio mínimo con y sin 1 mM de Cr(VI) respectivamente utilizando glucosa o glicerol como fuete de carbono. Luego de siete días de incubación, se cosecharon las células, se rompieron en prensa French y se tomó el extracto libre de células por centrifugación. Se determinó la actividad enzimática utilizando buffer fosfato de sodio, NADH y Cr(VI) como sustrato. Los resultados de actividad fueron de 49 y 22 nmol/min/mg de proteína a los siete días de crecimiento cuando el microorganismo creció con glucosa o glicerol sin el metal. Sin embargo esta actividad se redujo a 12 y 11 nmol/min/mg de proteína en el mismo tiempo de crecimiento. Posiblemente Cr(III) actúe con efecto de retro-inhibición. En base a estos resultados Streptomyces MC1 podría ser utilizada para la reducción de Cr(VI) en procesos biotecnológicos

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