INVESTIGADORES
RISSO marikena Guadalupe
congresos y reuniones científicas
Título:
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE ANTÍGENO H DE Histoplasma capsulatum EN Pichia pastoris
Autor/es:
VECINO RODRIGUEZ CECILIA; LOPEZ DANERI GABRIELA; RISSO MARIKENA; MUJICA MARIA TERESA
Lugar:
CABA
Reunión:
Congreso; VIII Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas SADEBAC; 2018
Resumen:
El diagnóstico serológico de la histoplasmosis se basa en reacciones de inmunodifusión para la detección de bandas M y H. La banda H presenta una homología con una β-glucosidasa e indica una forma crónica y severa dela micosis. Habitualmente la detección de esta inmunoprecipitación se realiza con antígenos producidos a partir del desarrollo fúngico con las implicancias en bioseguridad, limitada síntesis y variaciones que pueden ocurrir de lote a lote en la preparación del antígeno. Una alternativa lo constituye el objetivo de este trabajo: la expresión de proteínas recombinantes y específicamente los componentes del antígeno H en un sistema de expresión de la levadura metilotrófica, P. pastoris. Materiales y métodos: La secuencia proteica del antígeno H de Histoplasma capsulatum (GenBank U20346.1), depositada bajo el número de acceso AAA86880.1, cuenta en su estructura con las regiones "Glyco_hydro_3" desde el aminoácido 32 al 338 y la región ―BgIX‖ desde elaminoácido 81 al 425. Las secuencias codificantes correspondientes a cada región se sintetizaron por separado, cambiando el código genético del gen original y por el óptimo para su expresión en Pichia pastoris usando el algoritmo OptimunGene TM (GenScript). Se introdujeron sitios de restricción para las enzimas EcoRI, XhoI y SacI, el promotor PAOX1, el factor α (un péptido señal que dirige la secreción de las proteínas al medio de cultivo) y el gen asociado a la resistencia a la zeocina. Con estas construcciones insertadas en el vector pPICα A se transformaron bacterias Escherichia coli Top 10 quimiocompetentes y luego de purificar el plásmido mediante minipreparaciones de ADN (Wizard® Plus SV Minipreps, Promega), se transformaron levaduras metilotróficas P. pastoris X33 (Life Technologies Inc) mediante electroporación. La expresión de ambos constructos se realizó en medio BMMH (Medio Mínimo Metanol con Tampón de fosfato de potasio, pH 6.0) y cada 24 hs se agregó metanol a una concentración final del 1 % con agitación a 250 rpm a 28 °C cada 24 h hasta 118 h. El medio de cultivo con el desarrollo de P. pastoris se separó por centrifugación a los diferentes tiempos cada 24 h. Se realizó un fraccionamiento proteico en SDS-PAGE (gel de poliacrilamida 12% en presencia de SDS) previo y posterior al pasaje de las proteínas expresadas por una columna de Níquel (ProBond? Purification System) que retiene a los péptidos diseñados que presentan una cola de 6 histidinas. La tinción de los geles se realizó con azul de Coomassie. Resultados: Se optimizó la producción de ambos péptidos a los 5 días. BgIX y Glyco_hydro_3 fueronexpresados por P. pastoris con el tamaño esperado de 38 KDa y 25,6 KDa, respectivamente. Conclusión: P. pastoris constituyó un sistema de expresión de proteínas de H. capsulatum cuya antigenicidad será sujeta a posteriores estudios con el fin de obtener antígenos que puedan ser usados en pruebas serológicas para eldiagnóstico de la histoplasmosis.