Desarrollo de una técnica de PCR en materia fecal para estrongiloidosis sin requerimientos de kits comerciales.

REPETTO, SILCIA ANALIA; ALBA SOTO, CATALINA; CUELLO, MARIA SOLEDAD; TEKIEL, VALERIA; GONZALEZ-CAPPA ,STELLA MARIS

Mar del Plata.

Simposio; LIV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y LVII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología.; 2009

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

El diagnóstico habitual de Strongyloides stercoralis (Ss) es por observación directa de larvas en heces (H). La expulsión de larvas fluctúa en infecciones crónicas asintomáticas dificultando el diagnóstico. Las complicaciones clínicas son frecuentes en pacientes tratados con corticoides. Métodos más sensibles permitirían el tratamiento precoz y disminuirían estas  complicaciones. Sólo se ha reportado un trabajo donde emplean un kit comercial de purificación de ADN que permeabiliza la cutícula y elimina inhibidores en H pero encarece la técnica. Estandarizamos un método artesanal que combina un buffer de hidratación con glicina y diferentes métodos de lisis mecánica para desarrollar una PCR para Ss en H.. El ADN se purificó a partir de 1g de H conteniendo larvas (200 a 400). Las muestras se incubaron 12h (T°amb) en GTES (100mM glicina, 0,05% SDS, 10mM Tris/HCL, pH:8 y 1mM EDTA 0,5M), se lisaron  por congelación/descongelación y sonicación e incubaron 12 h (37°C) con buffer de lisis (100mM EDTA, 100mM NaCl, 100mM Tris pH:7,5 y 0,5% SDS, proteinasa K 100µg/ml). Luego de dos rondas de extracción con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), el ADN se precipitó con 2,5vol etanol 100% y se lavó con etanol 70%. La concentración y pureza se estableció por espectrofotometría. El rendimiento fue de 1.5 a 23,3 µg de ADN/g de H, con relación 260/280 entre 1,7 y 1.8. En la amplificación se emplearon: ADN 5 ul, BSA 100mg/ml, 2mM de Mg2+, 0,5μM de cada cebador (dirigidos contra 18S de rRNA), 0,4μM de dNTPs y 0,01U/μl de Taq polimerasa, en vol final: 20μl. Las condiciones de ciclado: 95ºC 3 min y 35 ciclos de 95ºC 5 s, 55ºC 1min y 72ºC 45s  y con 72ºC 5min. Se amplificó una banda única para Ss (100pb). En ausencia de BSA no se amplificó ADN de Ss. Concluímos que la extracción de ADN fue altamente satisfactoria y la PCR con BSA permitió detectar Ss en H. Estos resultados apoyan el desarrollo de una técnica sensible para el diagnóstico precoz de Ss en inmunocomprometidos.