Bioprospección de enzimas en una biblioteca metagenómica construida a partir de sedimentos costeros de Bahía Ushuaia

GONZALEZ, JESSICA; MUSUMECI, MATIAS; LOZADA, MARIANA; DIONISI, HEBE

Bahia Blanca

Simposio; XI Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO 2017; 2017

REDBIO

Lascomunidades microbianas que habitan ambientes marinos extremosresultan de particular interés para la bioprospección de enzimas.Un ejemplo de este tipo de ambientes es la zona intermareal cercana ala Planta de Combustibles Orión, en Bahía Ushuaia, Tierra delFuego. Estos sedimentos están expuestos a cambios bruscos detemperatura, humedad y salinidad, alta radiación UV-B, contaminacióncrónica por hidrocarburos y bajas temperaturas gran parte del año.Dada a la imposibilidad de cultivar la mayoría de losmicroorganismos marinos, en el Laboratorio de MicrobiologíaAmbiental hemos clonado grandes fragmentos de los genomas de estosmicroorganismos utilizando fósmidos como vector. Esta bibliotecametagenómica contiene aproximadamente 46.000 clones con insertos de35-45 Kb. A fin de facilitar la prospección de los genes de interés,la biblioteca fue secuenciada utilizando la plataforma Illumina HiSeq1500. El ensamblado de las lecturas generó un set de datosconformado por 105scaffolds y 7 x 105secuencias codificantes, la mayoría de ellas completas. Estos genesse encuentran fácilmente accesibles, dado que pueden seramplificados a partir de los fósmidos de la biblioteca.Elanálisis bioinformático de la biblioteca mostró que la mismacontiene fragmentos genómicos de organismos procariotaspertenecientes a 28 phyla, siendo los más abundantes Proteobacteria,Actinobacteria y Planctomycetes. La anotación de las secuenciascodificantes utilizando la herramienta BlastKOALA indicó lapresencia de 1,4 x 105secuencias correspondientes a enzimas putativas, de casi 2.000códigos EC diferentes. En el caso de las peptidasas, seidentificaron más de 8.000 secuencias pertenecientes a 79 familias(clasificación MEROPS) y 7 mecanismos de catálisis. Utilizandodominios pfam, se identificaron 342 secuencias correspondientes a lasubunidad mayor de hidroxilasas de compuestos aromáticos. Además,la herramienta dbCAN identificó 248 secuencias de alginato liasas de7 familias de polisacárido liasas, y 7 secuencias de fucoidanasas dela familia GH107 (clasificación CAZy).Enbase a análisis de contexto genómico, estructura primaria y/omodelado de la estructura tridimensional, se seleccionaros secuenciascon rasgos de potencial interés para su expresión heteróloga. Treshidroxilasas de hidrocarburos aromáticos fueron amplificadas,clonadas y expresadas en Escherichiacoli, como asítambién sus respectivas proteínas transportadoras de electrones.Estas enzimas catalizan la adición estereo-específica de dosoxhidrilos en anillos aromáticos y resultan de interés para laindustria química dado que producen compuestos con una quiralidadespecífica (llamados cis-dihidrodioles) en una simple etapa, que sonutilizados como intermediarios en la síntesis de distintos fármacos.Respecto a las CAZymas, se clonaron en E.coli 2 enzimasalginato liasas pertenecientes a la familia PL5, las cuales fueronpurificadas y mostraron capacidad de degradar alginatos medianteensayos de actividad enzimática, y se están clonando 4 enzimasfucoidanasas. Estas CAZymas, las cuales actúan, respectivamente, sobre enlaces internos de los polisacáridos alginatos y fucoidanospurificados a partir de algas pardas, resultan de interés para laproducción de oligosacáridos con propiedades bioactivas, con menorviscosidad y mayor absorción que los respectivos polímeros.p { margin-bottom: 0.25cm; direction: ltr; line-height: 115%; text-align: left; }a:link { color: rgb(0, 0, 255); }