Purificación de una nueva enzima fibrinolítica secretada por Hornodermoporusmartius LBM 224

ACOSTA GA; FONSECA, MI.; FARIÑA JI; ZAPATA, PD.,

Simposio; SAPROBIO 2021 - TRANSFIRIENDO BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO; 2021

Las enzimas fibrinolíticas producidas porhongos han cobrado gran importancia parael tratamiento de enfermedades del sistemacardiovascular. Nuestro grupo de trabajo haevaluado la capacidad HornodermoporusmartiusLBM 224 de producir enzimas extracelularescon actividad fibrinolítica (Fb),lo cual ofrece una ventaja a la hora de surecuperación y purificación, y ha optimizadolos parámetros de cultivo para la producciónenzimática de interés. El objetivo de estetrabajo fue purificar la enzima fibrinolíticaproducida por H. martius LBM 224.La purificación de la enzima fibrinolíticase realizó a partir del sobrenadante de cultivoen medio líquido optimizado (conteniendoen g/L: glucosa, 35; extracto de carne,5; NaCl, 2; KH2PO4, 0,5 y MgSO4·7H2O, 0,5)a los 21 días de incubación a 28 °C, el cualse separó del micelio por centrifugación a4.400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.El sobrenadante obtenido se filtró una membrana de fluoruro de polivinilidenode 0,22 μm obteniéndose un sobrenadanteenzimático libre de micelio y esporas.A continuación, se realizó una precipitaciónen dos etapas. En la primera etapa alsobrenadante se le adicionó 1 volumen deacetona fría (-18 °C) y se incubó con agitaciónconstante en baño de hielo durante 1h. Se centrifugó a 10.000 x g a 4 °C durante30 min y los precipitados obtenidos enesta primera etapa se resuspendieron enagua destilada (P1) para su evaluación. Porotro lado, a los sobrenadantes obtenidosde la primera precipitación se les adicionónuevamente 1 volumen de acetona fría bajolas condiciones anteriormente descriptas.Los precipitados obtenidos en esta segundaetapa se resuspendieron en agua destilada(P2) para su evaluación, mientras que lossobrenadantes se descartaron. La fracciónP2 se separó mediante ultrafiltración(MWCO 30 kDa) utilizando columnas PierceConcentrator (ThermoScientificTM). Las diferentesfracciones obtenidas: sobrenadantey cada etapa de recuperación/purificaciónparcial, se evaluaron mediante SDS-PAGEy la determinación de la cantidad de proteínasse realizó utilizando el reactivo deBradford (Sigma Aldrich®) con albúmina desuero bovino como estándar. La actividadFb se determinó mediante el método de degradaciónde fibrina de Wang et al. (2011)midiendo la absorbancia del producto dedegradación de la fibrina a 275 nm. Las unidadesde actividad enzimática, expresadascomo unidades de degradación de fibrina(FU), se definen como el incremento de 0,01unidades de absorbancia a 275 nm por minde reacción.Como resultado se obtuvo una enzimafibrinolítica purificada a homogeneidad, evidenciadapor la presencia de una sola bandade 29 kDa en SDS-PAGE, con actividadFb específica de 531,69 FU/mg, un factorde purificación de 3,9 y un rendimiento del35,47 %. Este método de purificación resultóser sencillo, económico y rápido, ya que norequiere equipos complejos y utiliza bajasproporciones de solvente, siendo una buenaalternativa para la purificación de la enzimafibrinolítica secretada por H. martius LBM224.