EXPRESIÓN DE UNA LACASA DE PHEBIA BREVISPORA EN KLUYVEROMYCES LACTIS

MOLINA, MELISA ANTONELLA; MILDE, LAURA, .; SGROPPO, SONIA CECILIA; ZAPATA, PEDRO DARÍO; FONSECA, MARIA ISABEL

Congreso; XIV Congreso Argentino de Microbiología General (XIV SAMIGE); 2019

Introducción y Objetivos: Phlebia brevispora BAFC 633 es un hongo de pudrición blanca que produce unalacasa principal de 60 kDa y una de 75 kDa, que han sido purificadas y caracterizadas. Ésta enzima puede serutilizada en procesos industriales, para lo que es necesario producirla en grandes cantidades y una manera delograrlo es expresándola en la levadura GRAS Kluyveromyces lactis, que es de elevado interés biotecnológicodebido a que tiene el potencial de expresar altos niveles y a gran escala proteínas recombinantes medianterápido crecimiento de alta densidad celular y sin presentar background de expresión celular durante los pasosde clonación en Escherichia coli.Materiales y Métodos: El presente trabajo tuvo como objetivo obtener lacasa recombinante a partir del ADNcaislado del hongo de pudrición blanca P. brevispora BAFC 633. Para ello, se realizó una amplificación por PCRutilizando como templado el gen previamente subclonado por el grupo y luego se digirió con las enzimas derestricción NotI y XhoI, al igual que el vector de expresión utilizado, pKLAC2. Estos productos fueron ligados yutilizados para realizar la transformación de las bacterias Escherichia coli utilizando ampicilina para la selección.Luego se llevó a cabo la extracción del ADN plasmidico mediante un procedimiento de lisis alcalina. La calidadde estos plásmidos se analizaron mediante electroforesis en geles horizontales de agarosa. Seguidamente seprocedió a la linealización con la enzima Sac II, de los plásmidos que resultaron contener el gen de interés y seprosiguió a la clonación dentro de la levadura K. lactis. Los recombinantes se seleccionaron mediante laaparición de un halo verde en medio YCB suplementado con ABTS. En todas las etapas se verificó la identidadde la secuencia mediante secuenciación y herramientas bioinformáticas.Resultados: De esta manera, los recombinantes que mostraron halos más intensos y grandes se seleccionaronpara continuar posteriomente con el estudio exhaustivo en medio líquido. Finalmente, se verificó que el marcode lectura de la proteína de interés es correcto con 1500 pb.Conclusiones: Estos resultados confirman que K. lactis es un hospedero apropiado para producir lacasa,sentando del mismo modo las bases para futuras investigaciones de la proteína, como así también para suaplicación en diferentes procesos.