Expresión heteróloga de una lacasa en Pichia pastoris

MOLINA A; WINNIK D; BUSI MV; FARIÑA JI; VILLALBA LL; ZAPATA PD; FONSECA MI

Mendoza

Congreso; XXXVI J. Arg. Bot. - XXVIII Reunión Anual Soc. Bot. Chile - Micología; 2017

Phlebia brevispora secreta la enzima lLacasa que se puede utilizar en aplicacionesindustriales. Para ello es necesario producirla en grandes cantidades y una manera delograrlo es expresarla en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. El objetivo deltrabajo fue obtener la región codificante de una lacasa de P. brevispora y expresarloen P. pastoris. El hongo creció en condiciones estandarizadas para obtener el ARNm.La región codificante se obtuvo por RT-PCR con primers específicos quecontemplaban o no la inclusión del péptido señal, los cuales fueron subclonados enpPIC3.5K y pPIC9.K respectivamente, utilizando Escherichia coli como huésped ymedio con ampicilina para la selección. Una vez obtenidos los plásmidos por lisisalcalina fueron secuenciados para corroborar la ausencia de errores en el mismo.PosteriormenteLos plásmidos obtenidos por lisis alcalina y secuenciados fuerondigeridos con SacI para transformar P. Pastoris, los recombinantes fueronseleccionados mediante la aparición de un halo verde en medio metanol minimo (MD)con ABTS. Luego fueron crecidos en MD y la actividad lacasa fue monitoreadaespectrofotométricamente.La región codificante consistió en un ORF de 1563pb que codifica genera una proteínade para 521 aa. El gen clonado usando el péptido señal del factor de apareamiento deSaccharomyces cerevisiae (500 U/L) fue más eficiente para dirigir la secreción de laproteína recombinante que el péptido señal nativo (30 U/L). Estos resultados confirman que P. pastoris es un huésped apropiado para producirlacasa, sentando las bases para futuras investigaciones de sobre/con la proteína,como así también para su aplicación en diferentes procesos