Aislamiento de basidiomicetes y amplificación de regiones ITS y LSU para su identificación

SCHWEIZER YD; SAWOSTJANIK AFANASIUK; GIORGIO EM; FONSECA MI; ZAPATA PD; VILLALBA LL

Jornada; Jornada Regionales de Genética; 2016

La aplicación de microorganismos y enzimas a procesos biotecnológicos requiere el aisla-miento e identificación de los mismos.En este sentido el objetivo de este trabajo fue aislar e identificar hongos causantes de pudri-ción banca nativos de la provincia de Misiones, secretores de enzimas oxidativas.Se evaluaron distintas metodologías para el aislamiento. Se utilizaron como material de parti-da piezas de basidiomas y madera en descomposición. En ambos casos se descontaminaron pasando por baterías de desinfectantes, variando las concentraciones y tiempos de exposi-ción. Luego se inocularon en placas con medios de cultivos estériles agarizados contenien-do, extracto de malta 12.7 g/L y Cloranfenicol 0.5 g/L. Las placas con los inóculos se incuba-ron en estufa a 28 °C.A partir de los aislados puros se procedió a la identificación molecular utilizando marcadores moleculares, los espaciadores internos transcritos (ITS) y la subunidad grande (LSU), del ADN ribosomal (rADN). Dichas regiones se amplificaron, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando iniciadores universales. Una vez obtenidos los fragmentos de in-terés fueron enviados a secuenciarse por MACROGEN KOREA.Se obtuvieron tres aislados axénicos correspondientes al phyllum basidiomycota. De los tra-tamientos analizados, el alcohol 96% durante treinta segundos, fue el que menor porcentaje de contaminación obtuvo utilizando como inóculo fragmentos de basidioma.En los tres aislados se logró amplificar por PCR dos fragmentos. Uno de 650 pares de bases correspondiente a la región ITS de los genes ribosomales, entre la subunidad pequeña, 5.8 y la grande 28S, incluyendo al gen 5.8S. El segundo fragmento amplificado, fue de 680 pares de bases correspondiente a los dominios D1 y D2 de la subunidad grande 28S. Los amplico-nes fueron visualizados en geles de agarosa 2% utilizando gelRed como colorante.Los fragmentos amplificados se enviaron a secuenciar a MACROGEN KOREA. Aguardando resultados.