UTILIZACIÓN DE ENZIMAS FÚNGICAS EN PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS I: CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DEL SISTEMA GENÉTICO FÚNGICO PRODUCTOR DE LACASAS Y CELULASAS

FONSECA MI; GIORGIO EM; ZAPATA PD; VILLALBA LL

Encuentro; 1º encuentro de Exposición de Proyectos de Investigación administrados por la UNaMTEC-SGCyT; 2011

La provincia de Misiones posee un marcado desarrollo industrial basado en la actividadforestal, con un crecimiento anual de alrededor del 10%, siendo una necesidad laimplementación de tecnologías limpias. En este sentido, una de las preocupaciones queconciernen a los procesos relacionados con estas industrias, es la minimización de fuentescontaminantes en los procesos de pulpado, blanqueo, fabricación del papel y tratamiento deefluentes de la industria celulósico-papelera (Scott et al., 1998). Otro desafío a la industriay la biotecnología es el aprovechamiento de material lignocelulósico como materia primaen la bioconversión a combustibles mediante el empleo de microooganismoslignocelulolíticos que ha tomado gran importancia en los últimos años debido a los altosprecios del petróleo y la disponibilidad de fuentes de almidón y sacarosa (maíz  y la cañade azúcar respectivamente) (Martinez Anaya et al., 2008).  Los hongos de pudrición presentan una amplia capacidad degradativa produciendo comoparte de su metabolismo un espectro de enzimas que se pueden aprovechar en estosprocesos. Se han descripto una amplia variedad de enzimas hidrolíticas (endoglucanasas,exoglucanasas,β-glucosidasas, endoxilanasas y xilosidasas) y oxidativas (ligninaperoxidasas, manganeso peroxidasas y lacasas) con capacidad de liberar productosmonómericos de la celulosa y hemicelulosa, así como de oxidar la lignina y otroscompuestos policíclicos que dificultan el acceso a la celulosa. No obstante, para laaplicación de enzimas fúngicas se necesitan seleccionar nuevas enzimas alternativas a las comerciales y optimizar su proceso de producción y aplicación. En este sentido el objetivodel presente proyecto fue optimizar la producción enzimática de cepas nativas de laprovincia de Misiones causantes de pudrición blanca eficientes productoras de enzimaslignocelulolíticas, para su potencial aplicación a procesos ligados a la industria celulósicopapelera:biopulpado,bioblanqueoy/obiorremediacióndeefluentesindustriales,asícomo,elinicio del estudio de las enzimas involucradas en la producción de bioetanol. Nuestrogrupo ha seleccionado y comenzado a estudiar sistemas enzimáticos de 5 hongos depudrición autóctonos de la Provincia de Misiones de elevada capacidad degradativa:Peniophora sp. BAFC 633, Ganoderma applanatum cepa F, Pycnoporus sanguineusBAFC 2126, Coriolus versicolor f. antarcticus (BAFC 266) y Trametes villosa BAFC2755 (Fonseca et al., 2010; Preussler et al., 2010; Shimizu et al., 2010). . La cuantificaciónde niveles de lacasa de estos hongos en condiciones basales y bajo la inducción con cobre(Fonseca et al., 2010) mostraron un aumento de la actividad enzimática ante la estimulación con cobre, sin embargo queda por verificarse si este aumento se debe a unamayor expresión génica o a un aumento en los niveles de traducción, plegamiento ysecreción de la enzima. En apoyo a esta hipótesis, nuestros datos previos sobre Trametesvillosa BAFC 2755 indicaron que existe una regulación a nivel traduccional correlacionadacon el aumento en la cantidad de ARNm y actividad de lacasa (Preussler et al., 2010). Porotro lado también se pudieron establecer las condiciones de temperatura y pH favorablespara el crecimiento de cada hongo en particular, la secreción proteica y la producción deenzimas lignocelulolitica, siendo Peniophora sp.,  la cepa que mostró mayor activadenzimática con un máximo a pH 4,5 en el día 10. describirse describireon tres isoenzimaspara T. villosa, y dos isoenzimas para C. versicolor var. antarcticus y Peniophora sp. Serealizaron además experiencias de producción enzimática mediante fermentación en estadosólido (SSF). Peniophora sp. BAFC 633, T. villosa BAFC 2755 y P. sanguineus BAFC2126 produjeron enzimas hidrolíticas y oxidativas en SSF de chips y aserrín. Tanto laendo-β-1,4-glucanasa como lacasa fueron las principales enzimas obtenidas.  Por otra parte, G. applanatum BAFC 1168 cepa F y C. versicolor var. antarcticus BAFC266 sólo produjeron enzimas hidrolíticas. En cuanto a la metodología de extracción de lasenzimas, se necesitó una segunda etapa de extracción  para recuperar la máxima cantidaddeenzima en las muestras de SSF en aserrín. Teniendo en cuenta la cantidad de azúcaresreductores liberados de aserrín, C. versicolor var. antarcticus BAFC 266 y Peniophora sp.BAFC 633 fueron las cepas más eficientes para la bioconversión de celulosa. Respecto a las técnicas de biología molecular utilizadas, la disrupción celular mecánicajunto con el detergente SDS combinado y la purificación mediante cloroformo posibilitó laobtención de ADN amplificable con un elevado rendimiento y una pureza aceptable. Sediseñaron cebadores mediante análisis bioinformático de los dominios conservados dexilanasas de la familia B (familia 11) en genomas de Basidiomicetos lo cual posibilitó eldiseño de cebadores degenerados que permitieron obtener fragmentos que pertenecerían agenes de xilanasas. Se han obtenido secuencias parciales del gen de lacasa en Peniophorasp. BAFC 633 y en Coriolus versicolor var. antarcticus BAFC 266 que fueron depositadasen la base de datos Genbank con los numero de acceso FJ416379 y FJ416378respectivamente (Fonseca et al., 2008).  El proyecto ha avanzado exitosamente. Se ha completado la formación de grado de 4tesistas de Licenciatura en Genética y actualmente se cuentan con 2 tesistas de grado y 2becarios doctorales de CONICET.