OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA LA AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN LAC EN TRAMETES VILLOSA

BARCHUK, MÓNICA L; FONSECA, MARÍA I; SAWOSTJANIK AFANASIUK, SILVANA S; GIORGIO, ERNESTO M; ZAPATA PEDRO, D; VILLALBA, LAURA L.

Jornada; VIII jornadas científico-tecnológicas de la FCEQyN-UNaM.; 2011

Trametes villosa, es un hongo de pudrición blanca que produce un amplio espectro deenzimas ligninolíticas que tienen la capacidad de degradar la lignina entre las cuales una delas más importante es la lacasa ya que es la única que utiliza como aceptor final deelectrones al oxigeno para degradar los sustratos. En este sentido existe un vasto y diversocampo de aplicación de enzimas fúngicas. Pero debido a que en la naturaleza la cantidadproducida por estos hongos no es suficiente para lograr un aprovechamiento industrialsustentable del hongo, es necesario lograr una sobreproducción de estos complejosenzimáticos. Esto podría lograrse mediante manipulación en la expresión génica de estasenzimas, siendo para ello necesario una mayor comprensión de los sistemas de regulaciónen este tipo de hongos y de los mecanismos involucrados en la expresión de estas enzimasen particular. El objetivo del trabajo fue estandarizar las condiciones para la amplificaciónde un fragmento del gen de lacasa en T. villosa T. villosa fue cultivado a 29 ºC en medio sólido conteniendo extracto de malta 12,7g/L, agar 20 g/L a pH 4,6 durante 5 días. A partir de éste se tomó un taco de 3 mm y seinoculó en medio líquido conteniendo extracto de malta 12,7 g/L, extracto soluble de maíz5 g/L a pH 4,6 mantenido en condiciones estáticas a 29 ºC durante 5 días. Se separó elsobrenadante del micelio y se utilizó éste último para la obtención de ADN. La PCR serealizó en un volumen final de 20 µl conteniendo 1X de buffer, 2,5 mM de MgCl, 200 µM decada uno de los dNTP, 10 pmol de cada uno de los cebadores (sentido y antisentido), 1 Ude Taq polimerasa y 30 ng/µl de ADN templado. El ciclado consistió de unadesnaturalización inicial de 94 ºC por 4 min, seguido de de 40 ciclos de 94 ºC por 40 seg.,50 ºC por 40 seg., 72 ºC por 40 seg., y una extensión final a 72 ºC por 10 min. La bandaobtenida se separó en un gel de agarosa 2 % se purificó del gel con Wizard (Promega)siguiendo las indicaciones del fabricante y fue secuenciado por el servicio de secuenciaciónMacrogen y la identidad fue corroborada in silico con BLASTn Se obtuvo una banda de tamaño esperado de 1600 pb cuya secuencia mostró unaidentidad del 70 al 90 % con la secuencia del gen que codifica para lacasa en otros hongosde pudrición blanca  Estos datos serán el puntapié inicial en la profundización del análisis de la regulaciónde la expresión genética del gen que codifica la enzima lacasa en T. villosa.   2