CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA Y ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN DE lacasa POR INDUCCIÓN CON CuSO EN Ganoderma applanatum CEPA A 4

AWOSTJANIK AFANASIUK SILVANA S; FONSECA MARÍA I; ZAPATA PEDRO D; VILLALBA LAURA L

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

Ganoderma applanatum es una especie perteneciente al grupo de hongos de de pudrición blanca, degradadores de lignina, que han cobrado interés por la potencial aplicación biotecnológica de sus enzimas ligninolíticas. Una de las enzimas más importantes del complejo es la lacasa. En este sentido se ha demostrado que el cobre aumenta su actividad en el hongo que aquí se analiza.  El objetivo del presente trabajo fue caracterizar los parámetros enzimáticos de lacasas producidas por G. applanatum cepa A, nativo de Misiones y determinar el efecto del CuSO4  sobre la expresión del gen de lacasa. Se realizaron cultivos de micelio en medio líquido (ME): extracto de malta 12,7g/l, extracto soluble de maíz 0,5% p/v; y en ME suplementado con CuSO4 0,2mM. La actividad enzimática se analizó por espectrofotometría utilizando el extracto enzimático crudo y como sustrato 2,6-dimetoxifenol (DMP) 5 mM, en buffer acetato de sodio 0,1 M. El cambio de la absorbancia se monitoreó a 469 nm (E469 = 27,5 mM-1cm-1 ). Se evaluaron las condiciones óptimas de actividad por medición a diferentes pH, y temperaturas. Luego se determinó la termoestabilidad, previa incubación del extracto enzimático por 20 minutos a diferentes temperaturas, realizando mediciones a 30 °C en condiciones óptimas de pH. El efecto del CuSO4 sobre la expresión del gen lac se analizó por medio de RT-PCR, utilizando ARN total semicuantificado, obtenido por extracción a partir de micelio cultivado durante 7 días en medio líquido (ME), con y sin CuSO4 Se observó la actividad enzimática óptima a pH 3,6, y a 55 °C, y una termoestabilidad superior por incubación del extracto a 4° C; el tratamiento con CuSO4 no produjo cambios en los parámetros (p>0,05), no así en el nivel de actividad, observándose en condiciones óptimas 2181 U/L de enzima en el extracto suplementado con CuSO4  y 118 U/L en el extracto sin CuSO4, siendo esta diferencia significativa, con un valor (P<0,001).  Asimismo quedó demostrado mediante RT-PCR que el agregado de CuSO4 produce un aumento significativo de la expresión del gen de lacasa.