OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA LA AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DEL GEN LAC EN Coriolus versicolor var. antarcticus BAFC 266.

BARCHUK, MÓNICA L; FONSECA, MARIA I; ZAPATA, PEDRO D; VILLALBA, LAURA L

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

Los hongos de pudrición blanca presentan un amplio espectro de enzimaslignocelulósicas entre las que se encuentran la lacasa. Las cuales poseen un granpotencial biotecnólogico. En la naturaleza la cantidad que producen no es suficiente paralograr un aprovechamiento industrial sustentable, por ello es necesario lograr unasobreproducción de estos complejos enzimáticos. Lo que podría lograrse mediante lamanipulación genética por lo que surge la importancia del conocimiento de secuenciasgénicas para llegar al propósito de clonación y expresión heteróloga. El objetivo del trabajo fue estandarizar las condiciones para la amplificación defragmentos del gen que codifica para la enzima lacasa en hongo de pudrición blanca.  Los hongos fueron cultivados a 29ºC en medio líquido conteniendo extracto demalta 12,7 g/L y extracto soluble de maíz 5 g/L a pH 4,6 durante  5 días. El micelio fueutilizado para la obtención de ADN por maceración mecánica y digestión con proteinasaK, SDS, β-mercaptoetanol en tampón Tris-HCL pH 8, EDTA y NaCl. Se purificó concloroformo:isoamílico y acetato de potasio, luego se precipitó en isopropanol 100 %,lavándose el pellet con etanol 70% y posteriormente resuspendiendo en agua estéril,almacenándolo a -20ºC. La PCR se realizó en un volumen final de 20 µl conteniendo 1 Xde buffer, 2,5 mM de ClMg, 200 µM de cada uno de los dNTP, 10 pmol de cada uno delos cebadores (sentido y antisentido), 1 U de Taq polimerasa y 30 ng/µl de ADNtemplado. El ciclado consistió de una desnaturalización inicial de 94ºC por 4 min, seguidode de 40 ciclos de 94ºC  por 40 seg., 50ºC por 40 seg., 72ºC por 40 seg., y unaextensión final a 72ºC por 10 min. 2Se obtuvieron bandas del tamaño esperado, de entre  1600 y 1800 pbaproximadamente, las cuales serán secuenciadas. Los datos aquí obtenidos serán el puntapié inicial en la profundización del análisisde la regulación de la expresión genética del gen que codifica la enzima lacasa enCoriolus versicolor  var.  antarcticus BAFC 266.