Evaluación del efecto del aserrín sobre la actividad de la enzima lacasa y obtención de un fragmento del gen en T. villosa

FONSECA, MARÍA. I; GIORGIO, ERNESRO ; TEJERINA, MARCOS; VILLALBA LAURA. L.; ZAPATA, PEDRO. D.

Posadas, Misiones

Jornada; VII Jornada Científico Tecnológicas; 2009

FCEQyN-UNaM

&amp;amp;amp;amp;lt;!-- /* Font Definitions */ @font-face {font-family:Verdana; panose-1:2 11 6 4 3 5 4 4 2 4; mso-font-alt:Verdana; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:536871559 0 0 0 415 0;} @font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-1610611985 1073750139 0 0 159 0;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:Calibri;} a:link, span.MsoHyperlink {color:blue; text-decoration:underline; text-underline:single;} a:visited, span.MsoHyperlinkFollowed {color:purple; text-decoration:underline; text-underline:single;} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --&amp;amp;amp;amp;gt; Los hongos de pudrición blanca poseen un sistema enzimático cuyas enzimas hidrolíticas y oxidativas actúan en la degradación de componentes de la pared celular como la lignina, celulosa y hemicelulosas. Son los únicos capaces de secretar enzimas oxidativas capaces de mineralizar la lignina hasta dióxido de carbono y agua. Para llevar a cabo la degradación de la lignina los distintos hongos ligninolíticos poseen un complejo enzimático con distintas funciones. Las enzimas oxidativas más ampliamente distribuidas son la Lignina peroxidasa (Lip), Manganeso peroxidasa (MnP) y Lacasa (Lac). La producción de enzimas del tipo fenol-oxidasas es lo que distingue a los hongos de pudrición blanca (HPB) de los demás basidiomicetes degradadores de madera y causantes de otros tipos de pudrición. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del aserrín sobre la actividad de la enzima lacasa y obtener un fragmento del gen en el hongo T villosa. Se extrajeron 6 tacos de 6 mm de diámetro a partir de cultivos del hongo, para lo cual se lo hizo crecer en placas de agar 10 (g/L) con extracto de malta (12g/L) y luego se inocularon en cultivos líquidos a pH 5,5  conteniendo 12.7 (g/L) extracto de malta  y 5 (g/L) de extracto soluble de maíz. Posteriormente se incubaron 3 días bajo agitación a 50 rpm para ser luego transferidos a frascos conteniendo 25 g de aserrín de madera de pino (Pinus taeda) con una de humedad de 60% manteniéndolos a 29 ± 1º C en condiciones estáticas por 32 días. Estos ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. Las enzimas fueron extraídas mediante dos lavados a 20ºC en condiciones estáticas durante 5 y 8 horas con 50 mM de buffer acetato de sodio pH 5,5 y Tween 20 (0,1 g/L). Para cada tiempo de extracción se extrajeron sobrenadantes del fluido extracelular recolectado y centrifugado con el objetivo de determinar la actividad enzimática. La actividad de lacasa se midió a 30ºC mediante espectrofotometría a 469 nm usando 5 mM de DMP (Dimetoxifenol) en 0,1 M de buffer acetato de sodio (pH 3,6). El análisis estadístico fue llevado a cabo con el programa GraphPad Prism. Para la amplificación por PCR se extrajo ADN de micelio cuyos productos fueron mandados a secuenciar y analizados mediante Blastn. Se encontraron diferencias significativas (P<0.001) en la actividad enzimática de lacasa entre las dos extracciones realizadas a diferentes tiempos. La actividad  luego de 8 h de extracción fue seis veces mayor (1566 U) que luego de 5 h (243 U). Se obtuvieron fragmentos de 200 pb los cuales mostraron un 80 % de identidad con lac2 de Trametes pubescens. Estos relevantes resultados motivan y requieren la profundización de estudios más extensos donde se incluyan otras variables para obtener las condiciones óptimas de producción enzimática tendientes a la aplicación en procesos biotecnológicos relacionados a la industria celulósica-papelera.