Diseño de cebadores para la amplificación de un fragmento del gen MnP en hongos de la pudrición blanca

FONSECA MI; EM GIORGIO; JI FARIÑA; LL VILLALBA; PD ZAPATA

Tandil

Congreso; XXXVII Congreso Argentino de Genética; 2008

<!-- /* Font Definitions */ @font-face {font-family:Garamond; panose-1:2 2 4 4 3 3 1 1 8 3; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:647 0 0 0 159 0;} @font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-1610611985 1073750139 0 0 159 0;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} p.MsoPlainText, li.MsoPlainText, div.MsoPlainText {margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; text-align:justify; mso-pagination:widow-orphan; font-size:10.0pt; font-family:"Courier New"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-font-family:"Times New Roman";} p.Default, li.Default, div.Default {mso-style-name:Default; mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; mso-layout-grid-align:none; text-autospace:none; font-size:12.0pt; font-family:Calibri; mso-fareast-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-font-family:Calibri; color:black;} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> Las industrias celulósico-papeleras presentan elevado impacto ambiental por lo que se realizan esfuerzos para disminuir fuentes de contaminación en los procesos de pulpado, blanqueo, fabricación del papel y tratamiento de efluentes. La aplicación biotecnología en estos procesos tiene el potencial de atenuar los problemas ambientales.  En este sentido los hongos de pudrición blanca presentan una amplia capacidad degradativa, produciendo enzimas con un claro aprovechamiento biotecnológico en la industria papelera. Por consiguiente, es importante desarrollar métodos moleculares para caracterizar genómicamente las enzimas en especies fúngicas con aplicación biotecnológica y profundizar en la comprensión de su regulación génica.  El objetivo del trabajo fue definir mediante herramientas bioinformáticas regiones útiles para el diseño de cebadores degenerados. Para ello se alinearon un conjunto de secuencias nucleotídicas del enzima Manganeso peroxidasa mediante el programa ClustalX 1.83, seleccionando las regiones conservadas, sobre las cuales se diseñaron 4 cebadores con una degeneración del 16 al 20%. La utilidad de estos cebadores fue confirmada por PCR  obteniéndose bandas de 255 y 290pb aproximadamente las cuales fueron secuenciadas, confirmando su identidad (80 al 93%) con hongos de la pudrición blanca por BLASTn.  Por otro lado se estandarizó la metodología para la extracción de ADN a partir de micelios. La cual se realizó por maceración mecánica y digestión con proteinasa K, SDS, β-mercaptoetanol en tampón Tris-HCL pH 8, EDTA y NaCl. Se purificó con cloroformo:isoamílico y acetato de potasio, luego se precipitó en etanol absoluto, lavándose el pellet con etanol 70% y posteriormente resuspendiendo en agua estéril, almacenándolo a -20ºC.