ESTUDIO PRELIMINAR DE TOXICIDAD DE UNA NUEVA ENZIMA FIBRINOLÍTICA FÚNGICA

ACOSTA GA; FONSECA, MI.; FARIÑA, JULIA INES; ZAPATA, PD.,

Jornada; 1ras Jornadas Institucionales INBIOMIS : 10 años construyendo biotecnología : libro de resúmenes; 2022

Las enzimas fibrinolíticas fúngicas son reconocidas como importantes agentes trombolíticosdebido a su capacidad para disolver los coágulos sanguíneos. Nuestro grupo optimizó losparámetros de producción y purificación de una nueva enzima fibrinolítica secretada porHornodermoporus martius LBM 224. El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad delsobrenadante de cultivo y de la enzima fibrinolítica purificada de H. martius LBM 224. Serealizó el ensayo de letalidad de 24 h en microplacas utilizando Artemia spp. como organismode prueba. Los huevos de Artemia spp. se incubaron en agua de mar estéril con aireaciónconstante a 25 ± 1 °C durante 48 h. Los nauplios fototrópicos maduros se recogieron y secolocaron de 10 a 15 organismos en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos con 100 μLde agua de mar. A cada pocillo se le agregaron por separado 100 μL del sobrenadante de cultivoy de la enzima purificada en buffer tris-HCl 50 mM pH 7,4. Como controles se utilizó: agua demar estéril, agua destilada estéril, medio de cultivo sin el hongo, sobrenadante de cultivodesnaturalizado por calor, buffer acetato de sodio 50 mM pH 3,6 y 4,8, buffer fosfato de sodio50 mM pH 5,6 y 6,7, buffer tris-HCl 50 mM pH 7,4. Además, se ensayaron el sobrenadante decultivo y el medio de cultivo sin el hongo, ajustados a pH 7 con NaOH concentrado. La placase incubó a 25 ± 1 °C durante 24 h. Luego se examinó con una lupa y se contó el número denauplios muertos (no móviles). Finalmente se añadieron 100 μL de metanol a cada pocillo ydespués de 15 min, se contó el número total de nauplios muertos. Los ensayos se llevaron acabo por quintuplicado y los resultados se expresaron como el porcentaje de mortalidad (%)para las diferentes condiciones ensayadas.Se demostró que la enzima purificada no exhibió toxicidad (0 % de mortalidad), mientras queel sobrenadante de cultivo mostró ser tóxico (100 % de mortalidad). Se comprobó que dichatoxicidad puede deberse no solo al pH sino también, a enzimas o compuestos termolábiles,debido a que al calentar el sobrenadante de cultivo ajustado a pH 7, la mortalidad se redujo del73 % al 2 %. Además, se ensayaron diferentes buffers para evaluar el efecto del pH sobre lamortalidad de las Artemias y se comprobó que el pH del medio influye directamente sobre esta,ya que a medida que este disminuyó, aumentó la tasa de mortalidad. Finalmente se ensayó elmedio de cultivo, que contenía 35 g/L de glucosa, y se observó un 100 % de mortalidad,demostrando la influencia de la isotonicidad del medio sobre la mortalidad.La prueba de Artemia spp. se considera una herramienta útil para la evaluación inicial de latoxicidad de micotoxinas, extractos y metabolitos fúngicos. Este método proporcionó datospreliminares que demostraron la ausencia de toxicidad de la enzima fibrinolítica purificada deH. martius LBM 224, los cuales deben ser respaldados por bioensayos más específicos.