DISEÑO DE CEBADORES DEGENERADOS PARA AMPLIFICAR EL GEN QUE CODIFICA PARA β-1,3-GLUCANASAS EN TRICHODERMA.

SIOLI, GA; CASTRILLO, ML; OTEGUI, MB; ZAPATA, PD; VILLALBA, LL

Salta

Congreso; XLI Congreso Argentino de Genética. III Reunión Regional SAG-NOA.; 2013

La capacidad de Trichoderma sp. de secretar β-1,3-glucanasas extracelulares se ha correlacionado con el control biológico de hongos patógenos vegetales, por su papel en la ruptura de las paredes celulares de los patógenos (Harman et al., 1993).Las β-1,3-glucanasas son enzimas que hidrolizan los enlaces O-glucosídicos de las cadenas de β-glucano por dos mecanismos. Las exo-β-1,3-glucanasas (EC 3.2.1.58) hidrolizan un sustrato mediante escisión de residuos de glucosa secuencialmente desde el extremo no reductor, y las endo-β-1,3-glucanasas (EC 3.2.1.39) escinden enlaces beta en sitios al azar a lo largo de la cadena de polisacárido, con la consecuente liberación de oligosacáridos cortos. La degradación de β-glucano por hongos a menudo se logra por la acción sinérgica de ambas endo-β y exo-β-glucanasas (Chesters& Bull, 1963b). Las β-1,3-glucanasas juegan un papel clave en los procesos morfogenéticos-morfolíticos durante el desarrollo y la diferenciación (Adams, 2004), y en la movilización de β-glucanos en respuesta a las condiciones de agotamiento de carbono y fuente de energía (Pitsonet al., 1993). Además, las β-1,3-glucanasas también son el arma de ataque bioquímico primario para la degradación de la pared celular de hongos parásitos (Martin et al., 2007). Una forma de favorecer su empleo industrial en la composición de productos utilizables para control biológico es identificar y caracterizar los sistemas génicos secretores de β-1,3-glucanasas. El objetivo del presente trabajo fue diseñar cebadores degenerados que permitan la amplificación de un fragmento génico que codifica para la enzima β-1,3-glucanasa en hongos del genero Trichoderma nativos de Misiones. Mediante el recurso bioinformático BLASTp (Basic Local AligmentSearchToolforprotein) del NCBI (National Center of BiotechnologyInformation) se realizó un análisis de similitud utilizando como referencia la secuencia aminoacídica de beta-1,3-glucanasa de Hypocrea rufa / Trichoderma viride (ABM55269.1) y fueron elegidas 14 secuencias por mayor porcentaje de identidad. Se realizó un alineamiento múltiple mediante el programa ClustalW2 y fue seleccionada una región conservada (A) para el diseño manual del cebador sentido y dos regiones para el cebador antisentido (B y C), basándose en el código genético. Los mismos fueron analizados ?in silico? mediante el programa FastPCR 6.4, pudiéndose concluir que la combinación cebador sentido A y los cebadores antisentido B y C proporcionan el contenido CG y la Tm recomendadas para su optima amplificación. Aun así, el fragmento entre los cebadores A y C resulta extremadamente grande y dificultaría su amplificación correcta. Por lo cual, la combinación de cebadores A y B resulta más adecuada para su utilización. De este modo, mediante la puesta a punto de la PCR sería posible obtener un fragmento génico de aproximadamente de 930pb.