Producción de enzimas recombinantes de amplia demanda en laboratorios de investigación

4. MANZUR MJ, MUÑOZ RV, LUCERO AA, JURI AYUB M, CIUFFO GM.

Buenos Aires

Congreso; CONGRESO INTERNACIONAL DE BIOTECNOLOGIA BAIRES-BIOTEC; 2005

(9) Producción de enzimas recombinantes de amplia demanda en laboratorios de investigación   María Jimena Manzur, Rosana V. Muñoz, Adrián Alejo Lucero, Maximiliano Juri Ayub, Gladys M. Ciuffo   Laboratorio de Biología Molecular, Univ. Nac. de San Luis, Ejército de los Andes 950, San Luis, Argentina. E-mail: gciuffo@unsl.edu.ar       Introducción   La demanda de enzimas de elevado costo en laboratorios de investigación nos llevó a desarrollar sistemas de producción de enzimas recombinantes en E. coli. De este modo se podrá contar con la capacidad para producir enzimas y proteínas recombinantes, ya que implica la puesta a punto del sistema. El objetivo del presente trabajo fue producir enzimas recombinantes de amplio uso en laboratorios, como la transcriptasa reversa MMLV, la Taq polimerasa y polimerasa Pfu.   Metodología   La metodología empleada fue similar para las tres enzimas e implica las siguientes etapas: a. Transformación de células competentes de la cepa  E. coli BL21, generadas con CaCl2, con el vector que contiene la proteína a expresar, mediante shock térmico. b.Inducción de la expresión con IPTG 1mM a distintos tiempos para cada enzima. c.Purificación del producto. Este paso varía en función de la enzima.    d. Ensayo de actividad o verificación del producto obtenido.   Para realizar la expresión se utilizaron vectores que contienen: el gen de la enzima Taq Polimerasa, el gen de la MMLV transcriptasa reversa, provistos por el Ing. Masuelli (Fac. Cs. Agrarias, Mza) y el gen de la polimerasa Pfu. A partir de los mismos se transformó una cepa bacteriana y a continuación se realizaron inducciones a distintos tiempos para determinar el tiempo requerido para obtener una mayor cantidad de enzima (Ausubel et al. 1999, Bollag et al., 1996). El seguimiento del proceso se realizó por SDS-PAGE y tinción con Coomasie Brillant Blue (CBB).       Fig. 1:  Purificación de Taq polimerasa. SDS-PAGE 12,5 %: Calle 1: proteínas solubles luego de 11 hs. de inducción con IPTG. Calle 2: sobrenadante de proteínas luego de la sonicación de bacterias. Calle 3: proteínas remanentes  luego de la  purificación.   Células competentes se prepararon por el método del CaCl2 y se transformaron por ´shock térmico´ que consiste en incubarlas con el vector  a 42 °C por 2 minutos y luego a 0 °C. Obtenidas las bacterias transformadas se realiza una expansión del cultivo e inducción del mismo mediante  adición de Isopropil b-tiogalactósido (IPTG) al medio. La expresión se determinó mediante el análisis de alícuotas de las bacterias en un gel de poliacrilamida. Como último paso se realizó la purificación de los productos de expresión, aprovechando la propiedad de resistencia a altas T de las enzimas  Taq  y  Pfu. El  producto de sonicación se calentó durante 1 hora a 75 °C, y luego se realizó  diálisis del sobrenadante durante  48  hs. en buffer de almacenamiento (Fig.1)(Ottino et al. 1998).   Para  la retrotranscriptasa, luego de la lisis por sonicación y tratamiento con lisozima, se realizan 2 lavados de los cuerpos de inclusión con buffer conteniendo Tritón X100 seguido de 3 lavados con buffer sin Tritón X100. Se recuperan los cuerpos de inclusión y resuspenden en buffer de solubilización (Tris, pH=8, 8M Urea). Por último se realizó la renaturalización y diálisis contra el buffer de almacenamiento a distintas concentraciones de Tritón X100. Como se observa en la Fig. 2 la concentración óptima corresponde a la de 0,5% de Tritón, que fue la de elección.   Fig. 2:  Purificación de la retrotranscriptasa desde cuerpos de inclusión a deferentes concentraciones de tritón X-100 en el buffer de diálisis. SN: fracción del sobrenadante antes de la diálisis. Las muestras se trabajaron por duplicado. SDS-PAGE al 7,5 %, tinción CBB.   Resultados y Discusión   Mediante la metodología empleada se expresaron y purificaron las enzimas recombinantes antes mencionadas, a partir de cultivos de E. coli BL21 (Fig.1 y 2). Los productos recombinantes obtenidos en nuestro laboratorio se utilizan para realizar múltiples reacciones de amplificación  de ADN animal, vegetal y viral con  excelentes resultados (CR. Pungitore et al., 2004). La Fig. 3 muestra un ejemplo donde se analiza la expresión de dos genes en forma simultánea (PCR Multiplex): el del receptor AT2 de Angiotensina II (Ang II) y el de GAPDH, utilizado como control. Tanto en la etapa de RT como en la fase de PCR, las enzimas utilizadas fueron las obtenidas en el laboratorio. Este análisis confirma que  ambas enzimas son funcionales, permitiendo inclusive la co-amplificación de dos fragmentos. Se observa un cambio en el nivel de expresión del receptor AT2 con el desarrollo.     Fig. 3: Análisis de productos de RT-PCR por PCR Multiplex, empleando las enzimas producidas. Coamplificación del receptor AT2  y GAPDH en cerebelo en distintos estadíos del desarrollo Panel superior: PND0 (PND: día post-natal) y PND4. Panel inferior: desde PND8 hasta PND60. Tinción con bromuro de etidio. El gel es representativo de 4 experimentos independientes. C+: control positivo.   Conclusiones   Los presentes resultados muestran que se logró obtener enzimas de buena calidad y con una actividad demostrada., aunque con menor actividad específica que la comercial (equiv. 2u/ml). La producción de enzimas recombinantes, como Taq polimerasa, MMLV transcriptasa reversa y Pfu polimerasa, resulta de gran utilidad para nuestro laboratorio, debido a la amplia utilización de las mismas en una variedad de aplicaciones como RT-PCR, identificación de genes por PCR, diagnóstico de virus HPV, entre otras. A partir de estos resultados concluimos que el proceso de producción de enzimas recombinantes  permitieron la puesta a punto del sistema de expresión de proteínas recombinantes.   Bibliografía   Ausubel FM et al. (1999). Short Protocols in Molecular Biology. Wiley USA.  Bollag DM et al. (1996). Protein Methods. Wiley USA. Ottino, P. et al. Rapid purification of high activity Taq DNA polymerase expressed in transformed E. coli cells. African Journals OnLine (AJOL) 72, 1998. CR. Pungitore et al.  Inhibition of Taq DNA polymerase by catalpol. Cell Mol Biol. 50(6), 767-772 (2004).