PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA MÁLICA DEPENDIENTE DE NADP (EM-NADP) DE COTILEDONES DE SOJA (Glycine max L. MERRILL) EN GERMINACIÓN. INTERACCIÓN CON UN POLIPÉPTIDO DE 94 kDa IDENTIFICADO COMO UNA LIPOXIGENASA (LOX).

FALCONE FERREYRA, MA. LORENA; DRINCOVICH, MA. FABIANA; ANDREO, CARLOS S; PODESTÁ, FLORENCIO E.

Santa Rosa, La Pampa

Congreso; XXV Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal.; 2004

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal

La EM-NADP cataliza la decarboxilación oxidativa del l-malato para producir CO2, piruvato, y NADPH (Edwards & Andreo, 1992). Además de su papel preponderante en la fotosíntesis C4 y CAM como decarboxilasa, su presencia en tejidos no fotosintéticos de éstas plantas y en diferentes tejidos de plantas C3 sugieren otras funciones catabólicas y/o anabólicas (Colombo et al. 1997). Además, la enzima ha sido implicada en las respuestas de defensa contra patógenos y estrés oxidativo (Walter et al. 1994, Maurino et al. 2001). El objetivo del presente trabajo fue investigar el papel de la EM-NADP en cotiledones de soja en germinación. Para ello, se procedió a su purificación y caracterización. La EM-NADP fue parcialmente purificada (33 veces) de cotiledones de soja de 7 días de germinación (tiempo en el cual la actividad fue máxima) con una actividad específica de 2,8 U/mg y un rendimiento del 41%. La separación electroforética desnaturalizante (SDS-PAGE) e inmunodetección por Western blot de la preparación final mostraron una masa molecular por subunidad de 65 kDa para la EM-NADP, mientras que fue evidente la preencia de un polipéptido de 94 kDa y otros dos de menor masa. El pI de la enzima purificada fue 6,9. Diferentes columnas cromatográficas utilizadas mostraron la coelución de la enzima con p94. Más aún, por SDS-PAGE de alícuotas de las fracciones eluídas con actividad EM-NADP se demostró la presencia de ambos polipéptidos. En lo que respecta a la caracterización cinética, la EM-NADP presentó un pH óptimo de 7,3 y los valores de Km estimados para sus sustratos NADP y l-malato fueron 33 mM y 0,78 mM, respectivamente. Con el propósito de estudiar si p94 estaba asociado a la EM-NADP en la estructura nativa, las bandas con actividad EM-NADP en geles no desnaturalizantes fueron analizadas por SDS-PAGE, observándose en ellos la presencia de ambos polipéptidos. Esta asociación tambien fue observada cuando los experimentos descriptos fueron realizados con extractos crudos, siendo además reforzada por estudios de inmunoprecipitación. Finalmente, p94 fue identificado como una lipoxigenasa mediante análisis por MALDI-TOF MS. En conclusión, la alta actividad alcanzada en la purificación indicaría un importante papel de la enzima en los cotiledones en germinación. Por otra parte, los resultados descriptos indican que la EM-NADP interacciona fisicamente con p94, una lipoxigenasa, lo que refuerza la noción de la participación de la EM en mecanismos de defensa . Referencias 1. Colombo, S.L., et al. 1997. Physiol. Plant. 101: 821-826. 2. Drincovich, M.F., et al. 2001. FEBS Lett. 490:1-6. 3. Edwards, G.E. & Andreo, C.S. 1992. Photosynth. Res. 31:1845-1857. 4. Maurino, V.G., et al. 2001. Plant Mol. Biol. 45: 409-420 5. Walter, M.H., et al. 1994. Eur. J. Biochem. 224:999-1009.