Chlamydia trachomatis modifica el tráfico vesicular mediado por Rab14 para asegurar su desarrollo

CAPMANY A; LEIVA N; DAMIANI MT

Mendoza, Argentina

Jornada; Jornadas de Investigación 2010; 2010

Chlamydia trachomatis es una bacteria Gram negativa intracelular obligada, la cual se multiplica en una única vacuola, no acídica, no degradativa, llamada inclusión. La bacteria, escapa de la vía endocítica y se traslada a la zona peri-Golgi, donde lleva a cabo su ciclo de replicación. En este ciclo se distinguen dos formas: una forma infectiva metabólicamente inactiva llamada “cuerpo elemental” (EB) y otra forma  no infectiva metabólicamente activa llamada “cuerpo reticular” (RB). Para su desarrollo, C. trachomatis intercepta lípidos provenientes del Complejo de Golgi, Cuerpos Multivesiculares y gotas lipídicas. Además, la bacteria  es capaz de reclutar ciertas proteínas Rabs, tales como Rab1, Rab4, Rab6 y Rab11. Las proteínas Rabs juegan un papel clave en la regulación del transporte vesicular. Estas proteínas ciclan entre un estado activo unido a GTP y un estado inactivo unido a GDP. Rab14, es una GTPasa localizada en la vía biosintética y endosomal temprana, que regula el tráfico de vesículas entre el complejo de Golgi y los endosomas. Rab14 está estrechamente relacionada con RabD de Dictyostelium, donde regula la fagocitosis, la fusión homotípica entre fagosomas y la formación del fagolisosoma. Además se ha señalado que Rab14 es crítica en el mantenimiento del bloqueo de la maduración del fagosoma de Mycobacterium tuberculosis. Nuestro objetivo es investigar si Rab14 participa en la biogénesis y desarrollo de la inclusión de Chlamydia trachomatis. Para ello se estudiaron células HeLa que sobreexpresan Rab14 wt y sus mutantes negativas: Rab14 S25N (forma inactiva asociada a GDP) y Rab14 ΔGCGC (forma citosólica) infectadas con C. trachomatis serovar L2 (agente causal de linfogranuloma venéreo) mediante microscopía confocal y electrónica. En la figura 1 se observa el reclutamiento de Rab14 a la membrana de la inclusión a lo largo del tiempo, analizado por microscopía confocal. Se puede ver que Rab14 se recluta a la membrana de la inclusión una vez que la bacteria ha llegado a la zona peri-Golgi  a las 10 hs pi (horas post-infección), permaneciendo durante todo el ciclo replicativo. Es llamativo ver que a tiempos tardíos de infección (48 hs pi) Rab14 se internaliza hacia el interior de la inclusión en forma de vesículas discretas. En la figura 2 se observa por microscopía confocal la distribución de la GTPasa Rab14 bajo distintos tratamientos en células HeLa que sobreexpresan dicha proteína fusionada a GFP e infectadas con C. trachomatis serovar L2 (MOI 10) y fijadas a 24hs pi. Bajo el tratamiento sostenido (22 hs pi) con 200 µg/ml Cloranfenicol (antibiótico que inhibe la síntesis proteica bacteriana) la bacteria no se desarrolla y GFP-Rab14 wt no colocaliza en los lugares donde se aloja la bacteria. Este hecho deja en claro que el reclutamiento Rab14 a la inclusión es activo y depende de la síntesis temprana de proteínas bacterianas. Por el contrario, la incubación de las células infectadas a 32°C, temperatura a la cual no se produce fusión homotipica entre inclusiones nacientes por ausencia de Inc A en la membrana de la inclusión, se observa que Rab14 se recluta a cada inclusión que se aloja en la zona peri-Golgi. Este resultado demuestra que el reclutamiento de Rab14 es independiente de IncA u otra Inc expuesta en la membrana de la inclusión cuyo transporte sea sensible a la temperatura.  Por otro lado el tratamiento con 1µg/ml Brefeldina A (desagrega el Aparato de Golgi) o  20µM Nocodazol (agente depolimerizador de microtubulos) no alteran el reclutamiento de Rab14 a la inclusión de la bacteria, por lo que Rab14 se recluta a la membrana de la inclusión independientemente de la integridad del Aparato de Golgi y los microtúbulos. En la figura 3 se observan células que sobreexpresan GFP-Rab14 wt  y sus mutantes negativas: GFP-Rab14 S25N (mutante unida a GDP) y GFP-Rab14 ∆GCGC (mutante carente del sitio de prenilación, no anclada a membrana) a las 24 hs luego de infectarlas con  Chlamydia trachomatis serovar L2. En estas imágenes se observa claramente que el reclutamiento de Rab14 es dependiente de su unión a GTP, ya que la mutante GFP-Rab14 S25N no se localiza en la membrana de la inclusión y por otro lado la sobreexpresión de la  mutante citosólica de Rab14 (GFP-Rab14 ΔGCGC) disminuye el tamaño de la inclusión de Chlamydia. Esto indica que es necesaria la presencia de Rab14 en la membrana de la inclusión para que ésta pueda desarrollarse normalmente. En la figura 4 se observan células HeLa transfectadas con los plásmidos de interés a 24 hs pi analizadas por microscopía electrónica. Pudimos determinar que la sobreexpresión de la mutante negativa citosólica de Rab14 genera inclusiones de menor tamaño que contienen bacterias aberrantes y cuerpos fantasmas, los cuales no son infectivos. Estos resultados permiten afirmar que Rab14 es necesaria para el desarrollo de la inclusión y la replicación de C. trachomatis.