SELECCION DE CEBADORES DE RAPD-PCR PARA ESTUDIOS EPIDEMIOLOGICOS EN CEPAS DE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

NOVOSAK, MARINA G.; BOBADILLA FERNANDO J.; LACZESKI MARGARITA E.; PEGELS EDUARDO R.; OVIEDO PATRICIA N.; QUIROGA MARINA I.; VERGARA MARTA I.

Posadas

Jornada; IX Jornadas Cinetífico Tecnológicas de la FCEQyN - UNaM; 2015

Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. UNaM

Streptococcus agalactiae, Streptococcus del grupo B (SGB) de Lancefield, fue reconocido inicialmente por Nocard y Mollereau en el año 1887 como agente infeccioso de mastitis de ganado vacuno, de donde recibe su nombre. Actualmente continúa siendo la primera causa de infecciones severas invasivas en lactantes menores de tres meses. Meningitis, neumonía y sepsis son los principales cuadros en estos niños. Estas infecciones se describen como las más graves que puede sufrir un individuo en sus primeras horas de vida. Diversos estudios realizados sobre aislamientos de SGB con fines epidemiológicos se basan en técnicas de serotipificación, sin embargo, estos procedimientos tradicionales tienen un poder discriminatorio bajo. A lo largo de las últimas dos décadas, se han desarrollado técnicas moleculares orientadas al estudio de la diversidad genética entre organismos estrechamente relacionados, entre ellas amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD). La técnica de RAPD ha ganado amplia aceptación. Es un método accesible y sensible basado en el uso de cebadores arbitrarios para amplificar segmentos polimórficos de ADN. La etapa crítica en la técnica de RAPD-PCR es la selección de los cebadores apropiados que permitan diferenciar cepas de un microorganismo dado.El objetivo de este trabajo fue realizar la puesta a punto de la técnica de RAPD-PCR utilizando cebadores descriptos en la literatura. Se trabajó con cuatro cepas (dos relacionadas y dos sin relación epidemiológica). Se utilizaron los cebadores OPS11, OPB17 y OPB18 con la finalidad de seleccionar aquel con capacidad de discriminar entre cepas no relacionadas genéticamente. En este sentido, para evaluar la utilidad de cada cebador, se utilizó la fórmula Hunter y Gaston (1988) que devuelve el Indice de Discriminación (D). Un D mayor que 0,90 es necesario para la interpretación de resultados de tipificación confiables.La reacción en cadena de la polimerasa se realizó con 50 ngµL-1 de ADN, obtenido utilizando la técnica de Sambrook modificada por Cariaga y Zapata, en un volumen final de 50 µL conteniendo 1X de buffer de TaqADN polimerasa (10X: 500 mM de KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 a 25°C; 1% Tritón®X-100), 100 mM de cada uno de los dNTPs; 0,4 mM de cada cebador y 2,5 U de la enzima TaqADN polimerasa (Inbio Highway, Argentina). Se utilizó una concentración de MgCl2 de 2,5 mM, siendo las condiciones de ciclado las siguientes: 5 min a 94°C; 40 ciclos de: 1 min a 94°C, 1 min a 36°C y 1 min a 72°C; 5 min finales a 72°C. La corrida electroforética se realizó en gel de agarosa al 1,2% a 100V, durante 3 h. Los geles fueron teñidos con GelRed®, en cuba electroforética con posterior observación de las bandas en transiluminador UV.Los resultados obtenidos permiten la selección del cebador OPS11 con D=1. Con los cebadores OPB17 y OPB18, no fue posible discriminar patrones que fueran concluyentes para su utilización en estudios epidemiológicos. Para ambos cebadores se obtuvo D=0,84.En conclusión la puesta a punto se logró utilizando el cebador OPS11 el cual será utilizado para estudios epidemiológicos en cepas de SGB utilizando RADP-PCR.