INVESTIGADORES
ROSSI juan pablo Francisco
congresos y reuniones científicas
Título:
Estado ocluído en la Bomba de calcio de membrana plasmática. Optimización del sistema de medida
Autor/es:
FERREIRA GOMES, MS, MC. DE LA FUENTE, GONZÁLEZ LEBRERO, R. ROSSI, R.C. Y ROSSI, JPFC.
Lugar:
La Plata
Reunión:
Congreso; 37 Reunión Annual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Biofísica
Resumen:
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La
bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína
transmembrana que acopla el transporte de Ca2+ hacia el medio
extracelular con la hidrólisis de ATP en ADP y ortofosfato inorgánico. Su
funcionamiento es esencial para el mantenimiento de la concentración de Ca2+
intracelular. Su ciclo de reacción involucra la formación de intermediarios fosforilados y la existencia
de transiciones
conformacionales, tanto entre formas fosforiladas (E1P↔E2P)
como desfosforiladas (E1↔E2). Se postula que el Ca2+
se encuentra ocluido en la forma E1P luego de unirse a sitios
citoplasmáticos de la enzima y antes de ser liberado al exterior celular, que
ocurriría luego de la transición E1P®E2P.
El objetivo de este trabajo es
identificar y caracterizar el intermediario en el que el Ca2+
estaría ocluido, E1P(Ca2+). Un punto clave para el éxito
de estos estudios es trabajar con microsomas con suficiente abundancia en PMCA,
lo cual se logró sobreexpresando la enzima en células Sf9 mediante
un sistema de Baculovirus. Esto produjo
un aumento de al menos diez veces en la actividad de la enzima. Un segundo
punto para optimizar las condiciones de trabajo es que, durante las reacciones,
la mayor parte de la enzima se encuentre en el intermediario E1P(Ca2+). Esto se logra agregado
LaIII que bloquea el cambio conformacional E1P®E2P.
Para
saber si la concentración de EP (que en presencia de LaIII se
encontraría mayoritariamente como E1P) es compatible con la cantidad
Ca2+ ocluido en la bomba, se midió EP utilizando [g-32P]ATP,
desnaturalización y precipitación en medio ácido seguido de electroforesis en SDS
y autorradiografía (Echarte y col. Anal. Biochem. 289, 267-273, 2001). La cantidad de EP medida fue cercana a 800
pmol EP/mg PMCA, compatible con resultados de la cantidad de Ca2+ que
presumiblemente se ocluye en la
PMCA, obtenidos en condiciones similares en nuestro
laboratorio.
Experimentos
en los que se midió la cantidad de EP en función de la concentración de PMCA
mostraron un aumento de la cantidad de EP por masa de PMCA a medida que la
concentración de proteína disminuía. Estos resultados concuerdan con otros
obtenidos en nuestro laboratorio (Vanagas y col, Biochim Biophys Acta. 1768(6):1641-9. 2007)
en los que la actividad Ca2+‑ATPasa de la PMCA aumenta con la
disminución de la concentración de la enzima.
Con
subsidios de ANPCYT, CONICET y UBACYT