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La bomba de Ca 2de membrana plasmática (PMCA), es una proteína integral que pertenece a las P-ATPasas. Dada su escasa concentración en las células eucariotas, se han empleado diversos métodos para obtener preparaciones concentradas como la expresión transitoria en células de insecto. El objetivo de nuestro trabajo consiste en expresar en forma estable la isoforma h4b de la PMCA en un sistema que emplea la transfección -mediada por lípidos- en células de insecto Sf9 y comparar la proteína recombinante así obtenida con la misma isoforma expresada de manera transitoria empleando el sistema de baculovirus. Para ello se procedió a digerir con enzimas de restricción tanto el plásmido pSG5, que contenía la secuencia de la PMCA, como el plásmido pIB/V5 His Topo en el cual se ligase el inserto de interés. Luego de la ligación se transformó en células ultracompetentes (aclarar cuales). A partir de las colonias obtenidas se purificó el vector recombinante. El tratamiento con diferentes enzimas de restricción corroboró en primera instancia la presencia de la PMCA en el plásmido. Una vez clonado el gen, se transfectó en forma transitoria usando el lípido cellfectine. Este paso permitió testear que la PMCA se expresa en el sistema. Para ello se realizaron experimentos de Western blot empleando el anticuerpo monoclonal específico 5f10. Los experimentos siguientes se realizarán para obtener la transfección estable del plásmido utilizando cellfectine y la consiguiente selección de los clones celulares que sobreexpresen la PMCA. La selección se realizará utilizando Blasticidina, un antibiótico específico para células de insecto dado que el vector pIB le confiere a las células transfectadas resistencia a dicho antibiótico. La expresión de PMCA en este sistema permitirá (1) obtener una masa significativa de proteína biológicamente activa, mejorando así los rendimientos obtenidos con los sistemas empleados hasta el momento y (2) estudiar las características cinéticas y estructurales de la PMCA y compararlas con la PMCA obtenida mediante la expresión transitoria utilizado en el laboratorio. Con subsidios de ANPCYT, CONICET, UBACYT y de NIH.

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