PMCA subcloning and expression in an insect stable cell line.

CANDELARIA DE LA FUENTE; HUGO ADAMO; ROSSI, J.P.F.C.

MAR DEL PLATA

Congreso; 43th Annual Meeting Argentine Society for Biochemistry and Molecular Biology; 2007

SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACION BIOQUÍMICA

“ Subclonado y expresión de la PMCA en una línea celular estable de células de insecto María Candelaria de la Fuente, Hugo P. Adamo y Juan Pablo F.C. Rossi. IQUIFIB (UBA-CONICET) Dep. de Química Biológica. F.F. y Bioquímica, UBA.   La bomba de calcio de membrana plasmática de mamíferos (PMCA) es una ATPasa de tipo P que transporta iones Ca2+ a expensas de la energía libre proveniente de la hidrólisis de una molécula de ATP. La PMCA se encuentra codificada por cuatro genes pero por el procesamiento alternativo (splicing) del RNA obtenido de cada gen existe una amplia variación transcripcional. La expresión de estas isoformas en la membrana plasmática de eucariotas  ha sido confirmada por detección con anticuerpos específicos. Los anticuerpos muestran que algunas variantes son ubicuas (isoformas 1b y 4b) pero la mayoría tienen una localización altamente selectiva (por ejemplo la PMCA 3f en músculo esquelético y la 2a en el oído interno). El objetivo de nuestro trabajo consiste en subclonar y expresar la PMCA en un sistema novedoso que emplea la transfección de células de insecto Sf 9 con un plásmido específico, que contiene la secuencia de la isoforma h4b de la PMCA, que es la mayoritaria de la membrana plasmática de glóbulos rojos. Para ello procedimos a digerir con enzimas de restricción tanto el plásmido inicial (pSG5) que contenía la secuencia de la PMCA (BamH I, Xba I y Sal I), como el plásmido pIB/V5 His Topo ( BamHI y XbaI) en el cual se ligaría posteriormente nuestro inserto de interés. Previa a la ligación, el plásmido pIB fue tratado con fosfatasa alcalina para evitar su religación. Cabe recalcar que dicho plásmido posee en su secuencia un promotor fuerte y temprano (OpiE2) de Baculovirus, virus especie específico de células de insecto, el cual bajo su regulación se controlará la expresión constitutiva de la PMCA. Luego de la ligación (overnight, a 4ºC) se transformó en células ultracompetentes (Top Ten- Invitrogen). Las colonias obtenidas fueron purificadas (Extraction kit/ Quiagen) y se chequeó el tamaño del plásmido ligado por una electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos tras la digestión con las mismas enzimas de restricción utilizadas para el subclonado. Los tamaños visualizados coincidieron con los esperados para la ligación. Actualmente estamos optimizando la transfección de nuestro plásmido en células de insecto Sf9 empleando el lípido cellfectin, que favorece la incorporación de DNA a las células. Una vez puesta a punto la transfección mediada por lípidos, se seleccionarán los transformantes estables y  se realizará una expresión a gran escala de la PMCA. También se verificará la expresión mediante experimentos de Western Blot y se someterá a la proteína a distintos estudios de caracterización cinéticos, y estructurales. La importancia de expresar la PMCA en un nuevo sistema con una línea celular estable de células de insecto, radica en obtener una masa significativa de proteína biológicamente activa. Esto permitirá la comparación de la enzima con la obtenida por expresión transitoria, lo que permitirá a) estudiar las variaciones en la expresión de PMCA y b) mejorar los rendimientos obtenidos con los sistemas de expresión empleados hasta el momento.   Subclonado y expresión de la PMCA en una línea celular estable de células de insecto María Candelaria de la Fuente, Hugo P. Adamo y Juan Pablo F.C. Rossi. IQUIFIB (UBA-CONICET) Dep. de Química Biológica. F.F. y Bioquímica, UBA.   La bomba de calcio de membrana plasmática de mamíferos (PMCA) es una ATPasa de tipo P que transporta iones Ca2+ a expensas de la energía libre proveniente de la hidrólisis de una molécula de ATP. La PMCA se encuentra codificada por cuatro genes pero por el procesamiento alternativo (splicing) del RNA obtenido de cada gen existe una amplia variación transcripcional. La expresión de estas isoformas en la membrana plasmática de eucariotas  ha sido confirmada por detección con anticuerpos específicos. Los anticuerpos muestran que algunas variantes son ubicuas (isoformas 1b y 4b) pero la mayoría tienen una localización altamente selectiva (por ejemplo la PMCA 3f en músculo esquelético y la 2a en el oído interno). El objetivo de nuestro trabajo consiste en subclonar y expresar la PMCA en un sistema novedoso que emplea la transfección de células de insecto Sf 9 con un plásmido específico, que contiene la secuencia de la isoforma h4b de la PMCA, que es la mayoritaria de la membrana plasmática de glóbulos rojos. Para ello procedimos a digerir con enzimas de restricción tanto el plásmido inicial (pSG5) que contenía la secuencia de la PMCA (BamH I, Xba I y Sal I), como el plásmido pIB/V5 His Topo ( BamHI y XbaI) en el cual se ligaría posteriormente nuestro inserto de interés. Previa a la ligación, el plásmido pIB fue tratado con fosfatasa alcalina para evitar su religación. Cabe recalcar que dicho plásmido posee en su secuencia un promotor fuerte y temprano (OpiE2) de Baculovirus, virus especie específico de células de insecto, el cual bajo su regulación se controlará la expresión constitutiva de la PMCA. Luego de la ligación (overnight, a 4ºC) se transformó en células ultracompetentes (Top Ten- Invitrogen). Las colonias obtenidas fueron purificadas (Extraction kit/ Quiagen) y se chequeó el tamaño del plásmido ligado por una electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos tras la digestión con las mismas enzimas de restricción utilizadas para el subclonado. Los tamaños visualizados coincidieron con los esperados para la ligación. Actualmente estamos optimizando la transfección de nuestro plásmido en células de insecto Sf9 empleando el lípido cellfectin, que favorece la incorporación de DNA a las células. Una vez puesta a punto la transfección mediada por lípidos, se seleccionarán los transformantes estables y  se realizará una expresión a gran escala de la PMCA. También se verificará la expresión mediante experimentos de Western Blot y se someterá a la proteína a distintos estudios de caracterización cinéticos, y estructurales. La importancia de expresar la PMCA en un nuevo sistema con una línea celular estable de células de insecto, radica en obtener una masa significativa de proteína biológicamente activa. Esto permitirá la comparación de la enzima con la obtenida por expresión transitoria, lo que permitirá a) estudiar las variaciones en la expresión de PMCA y b) mejorar los rendimientos obtenidos con los sistemas de expresión empleados hasta el momento.