Obtención de preparaciones mejoradas de PMCA en líneas celulares de Spodoptera frugiperda (Sf21)

SAMSA, MM; ROSSI, J.P.F.C.

Mar Del Plata

Congreso; I Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas; 2004

Sociedades Biomédicas

PURIFICACIÓN Y OBTENCIÓN DE PREPARACIONES MEJORADAS DE PMCA EXPRESADA EN LÍNEAS CELULARES DE INSECTO SPODOPTERA frugiperda Samsa, M. y Rossi J.P.F.C. IQUIFIB. Fac.de Farmacia y Bioquímica, Junín 956. Buenos Aires, Argentina. samsa@qb.ffyb.uba.ar   La Ca2+ ATPasa de membrana plasmática PMCA, es una proteína estructural de membrana plasmática codificada por una familia multigénica, de las cuales se conocen 4 isoformas que a su vez generan una amplia variación a nivel trancripcional mediante empalme alternativo. Debido a su alto peso molecular (134000 daltons) y a sus 10 dominios transmembrana que necesitan de una correcta inserción en el entorno lipidico, presenta dificultades para su expresión eficiente en forma enzimáticamente activa. En colaboración con la Mayo Clinic Foundation (Rochester, MN) utilizamos baculovirus recombinantes de las isoformas 2b y 4b bajo la regulación del promotor de polihedrina. Con este material hemos logrado la expresión y preparación de microsomas inside-out, con una actividad de 18 micromol/mg/ de proteína/hora para la isoforma r2b y 16 y 32 micromol/mg/h para la isoforma h4b en presencia y en ausencia de calmodulina respectivamente. Estos niveles de actividad específica fueron alcanzados al 2do día post-infección con un moi de 1 en Sf21 y son similares a las informadas en la literatura científica. Cuando realizamos un seguimiento de la actividad específica en preparaciones microsomales provenientes de infecciones con baculovirus de la isoforma r2b a intervalos de tiempo de 24 hs post-infección, hemos visto un alto nivel de expresión en los días 2 y 3 alcanzando mas de un 30 % de PMCA respecto al total de proteínas, mientras que el porcentaje respecto del control sin infectar es del 0.1%. Esto implica que se obtienen 300 veces más PMCA que en las células sin expresar. No obstante, los valores de actividad específica de Ca2+-ATPasa alcanzados respecto a proteínas totales, solo se triplicaron en ausencia de calmodulina respecto al control en los días 2 y 3, mientras que la actividad especifica de PMCA fue significativamente menor respecto del control, alcanzando un máximo en el día 4 post-infección. Estos resultados indican que la mayor parte de la proteína expresada se encuentra en forma inactiva, debido probablemente a la expresión acelerada de la proteína de membrana por estar bajo un promotor extremadamente fuerte como es el de polihedrina, que no permite el correcto plegamiento de la PMCA. Para resolver este problema decidimos encarar a): la purificación de la PMCA sobreexpresada para tratar de recuperar tras la extracción con detergente C12E10 y reinserción de la enzima en asolectina, una mayor actividad específica y b): utilizar un promotor que blabla. Por otra parte estamos tratando de localizar intracelularmente el destino de la proteína expresada mediante inmunocitoquimica, y en base a estos resultados poder establecer las condiciones más adecuadas para obtener una mayor actividad específica de la PMCA.