Activación de la PMCA por Dilución. Estudio en Microsomas de Células de Insecto

VANAGAS, L.; CARIDE, AJ; ROSSI, J.P.F.C.

Mar Del Plata

Congreso; I Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas; 2004

Sociedades Biomédicas

ACTIVACIÓN DE LA PMCA POR DILUCIÓN. ESTUDIO EN MICROSOMAS DE CÉLULAS DE INSECTO Vanagas L., Caride A J y Rossi J.P.F.C. IQUIFIB. Fac.de Farmacia y Bioquímica, Junín 956. Buenos Aires, Argentina. lvanagas@qb.ffyb.uba.ar La bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) es una proteína de 127000 a 134000, que se encuentra ampliamente distribuida en células eucariotas. Es una P-ATPasa regulada por calmodulina, fosfolípidos ácidos, proteín quinasas, etc. codificada por una familia de multigenes. La PMCA no supera el 0.1% del total de proteínas de membrana, por lo que resulta difícil estudiarla en su entorno natural. Recientemente se han sobreexpresado diferentes isoformas de PMCA en células de insecto (sf9 o sf21) mediante un baculovirus que brinda una preparación de alta actividad específica. Hemos estudiado el efecto de la dilución de suspensiones de membranas de eritrocitos humanos, lo que produce la activación específica de la PMCA (congreso SAB SAIBMB 2003). Este estudio continuó en preparaciones microsomales de células sf9 o sf21 sobreexpresando la isoforma h4b que es la predominante en eritrocitos humanos. Se realizaron medidas de actividad, por los métodos de Fiske y Subbarrow y Baginski, variando la concentración de proteínas totales lo que produce un aumento de la actividad específica entre 1.5 y 5 veces en las suspensiones diluidas respecto de las concentradas. Este efecto se manifiesta tanto en ausencia como en presencia de concentraciones saturantes de calmodulina. El estudio cinético de la actividad de Ca2+-ATPasa, mediante el método desarrollado por Webb (Proc. Natl.Acad.Sci, 89, 884-887, 1992) demostró que la actividad específica aumenta de 0.02 a 0.038 mmol Pi.mg prot-1.min-1 en suspensiones diluídas, y, con el agregado de calmodulina, de 0.099 a 0.189 mmol Pi.mg prot-1.min-1 . El fenómeno puede describirse como una activación bifásica (activación- inhibición) dependiente del grado de expresión de la PMCA. Resultados preliminares indican que este fenómeno también aparece en la isoforma 2b. (yo no pondría lo que está en verde, porque lo primero no está comprobado y con 2b no hice nada)  realizó estudios en el mismo sistema pero midió la actividad monitoreando contínuamente la absorbancia a 360 nm y obtuvo también el doble de actividad cuando la preparación estaba diluida. Mediante este método pudo también obtener las constantes de activación por calmodulina, siendo ésta mayor cuando la preparación es concentrada que cuando es diluida.