Obtención de un antígeno recombinante derivado de la proteína NS1 del Virus del Dengue Serotipo 3 en E. Coli, con potencial aplicación en diagnóstico

MALNERO C ; PAREDES ROJAS Y ; RIPPETA MS; IBAÑEZ LI ; BERGMANN I; MALIRAT V

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016

El virus Dengue (DENV), arbovirus de la familia Flaviviridae,con cuatro serotipos identificados, es el agente causal de la fiebre Dengue . En Argentina estaenfermedad se presenta como epidemias, resultando la del año en curso la peoren la historia del país. Hasta la semana 17, el Ministerio de Salud informó 34.992casos confirmados y/o probables. Se trata de una situación preocupante ya que nose cuenta con vacunas ni terapias antivirales eficaces. La mejor forma decontrolar la enfermedad es el control del vector y el diagnóstico rápido ypreciso de los casos clínicos. Si bien existen disponibles kits comerciales parala detección de proteínas virales y anticuerpos contra el virus en suero depacientes, se han informado problemas de reactividad cruzada con otros virus,principalmente flavivirus. Estos kits son importados y se comercializan aprecios elevados. El objetivo de este trabajo es evaluar la capacidadde un antígeno recombinante, derivado de la región que codifica para laproteína NS1 del DENV y expresado en un sistema procariota, de ser usado endiagnóstico y eventualmente para investigación viral básica.La metodología empleada incluyó: infección viral en célulasVero con el DENV-3 y extracción de ARN del sobrenadante. Luego se amplificó porRT-PCR una región del genoma viral que contiene la secuencia codificante de laproteína NS1 con iniciadores diseñados para tal fin. Los amplicones obtenidos seclonaron en el vector de expresión pET28a que contiene un tag de histidinas. La expresión de la proteína recombinante,rNS1-D3, se realizó por inducción con IPTG en diferentes condiciones,visualizándose los resultados mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando unanticuerpo primario anti-histidina. Los métodos de purificación probadosincluyeron solubilización conurea, seguido de electroelución o de afinidad con resina de cobalto. Concomitantemente se inmunizaron ratones Balb/ccon virus inactivado siguiendo el siguiente esquema: primera inmunización conDENV-4 y dos re-inmunizaciones sucesivas con DENV-2 y DENV-1+3. La capacidadantigénica de la rNS1-D3, se evaluó mediante un Western blot empleando comoanticuerpo primario sueros de ratones referidos anteriormente.Los resultadosobtenidos mostraron buena expresión de  rNS1-D3en la cepa Rosetta Gami 2 pLyss a 37°C, con niveles similares cuando seprobaron  los medios Luria, Terrific yEstándar 1. La proteína se obtuvo en la fracción precipitable del lisadobacteriano y se logró su purificación con buena eficiencia de recuperación. La rNS1-D3producida en este sistema mostró reactividad contra los anticuerpos de ratonesinmunizados con DENV inactivado.En conclusión, fueposible clonar y expresar un antígeno recombinante derivado de la proteína NS1del DENV-3, con buenos niveles de producción, que se muestra prometedor para eldesarrollo de kits de diagnóstico del virus del dengue, a costos de produccióncompetitivos, y adicionalmente puede ser empleado para trabajos deinvestigación.