DESARROLLO DE UN KIT DE DIAGNÓSTICO DE DENGUE BASADO EN NANOANTICUERPOS

PAREDES ROJAS YESICA; MALNERO CRISTIAN; CALDEVILLA CECILIA; GARCÍA, CYBELE; MATTION NORA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ

Buenos Aires

Simposio; IV Simposio Internacional de Virología Clínica y Avances en Vacunas; 2016

El Dengue es una enfermedad viral transmitida por mosquitosque se ha vuelto endémica en Argentina. En el suero de pacientes infectados esposible detectar la proteína viral NS1, lo que ha permitido el desarrollo dekits diagnóstico de la enfermedad. Los Nanoanticuerpos (NanoAcs) son fragmentosde anticuerpos de cadena pesada obtenidos desde camélidos que representan unapotencial herramienta para la detección de proteínas del Dengue. Son pequeñas moléculasde gran afinidad y especificidad, termoestables, que se pueden expresar a bajocosto en microorganismos y se pueden modificar fácilmente por técnicas estándarde biología molecular. Teniendo en cuenta la necesidad de contar con sistemasde detección innovadores y de menor costo que los actuales, en este trabajo reportamosla obtención y caracterización de NanoAcs con capacidad de reconocer la proteínaNS1 del virus Dengue.Se inmunizaron dos llamas con sobrenadantepurificado e inactivado de células infectadas con Dengue que contenía altosniveles de NS1. Una vez alcanzada una respuesta inmune adecuada, se extrajo ARNde linfocitos. Se preparó ADNc y se amplificaron las regiones codificantes del fragmentovariable de la cadena pesada mediante PCR, para luego ser clonados en el vectorfagémido pHEN4. Este plásmido fue transformado en bacterias TG1 que fueronposteriormente infectadas con un fago helper.Los NanoAcs candidatos se seleccionaron por biopanningen fase sólida usando la proteína NS1 recombinante, y posteriormente sepurificaron del periplasma bacteriano. Los clones candidatos se analizaron por ELISAy su variabilidad se determinó por PCR de colonias individuales seguida de digestiónenzimática.Se obtuvieron dos bibliotecas de aproximadamente 1x108transformantes que poseían al menos un 88% de insertos de tamaño correcto. Luegode 3 rondas de biopanning utilizandodiferentes métodos de elución, se aislaron 192 clones que fueron analizados porELISA. Se pudo determinar que los NanoAcs producidos reconocen de maneraespecífica a la proteína NS1. Se espera poder modificar y expresar a gran escala losclones seleccionados para poder en un futuro cercado, generar un kit diagnósticoque permita la detección temprana de la infección por virus de Dengue.