Obtención de la proteína recombinante NS1 de los cuatro serotipos del virus del dengue y su utilización en la producción de anticuerpos monoclonales

MALNERO C; PAREDES ROJAS Y; IBAÑEZ LI; BERGMANN I; MALIRAT V

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue (DENV), del cual seconocen 4 serotipos, causa una enfermedad que constituye un problema importantede salud pública. En Argentina la mayor epidemia se produjo en el año 2016, conmás de 40.000 casos confirmados. El diagnóstico se basa en la utilización dekits comerciales importados, los cuales presentan además de un costo elevado,una proporción de reactividad cruzada con otros flavivirus. Teniendo en cuentael impacto socio-económico que tiene la enfermedad tanto en nuestro país comoen la región, es de gran interés desarrollar métodos de diagnóstico yprevención eficaces.El objetivo de este trabajo es laobtención de antígenos recombinantes derivados de la proteína NS1 del DENV y suaplicación para la obtención de anticuerpos monoclonales específicos. Lasregiones correspondientes a la NS1 de los cuatro serotipos, fueron clonadas enel vector de expresión pET28a conteniendo un tag de histidina. La proteínarecombinante (rNS1) fue expresadas en la cepa de E. Coli Rossetta-gami 2 pLyssy purificada por solubilización diferencial con urea a partir de cuerpos deinclusión seguida de cromatografía de afinidad (IMAC) con columna HisTrap HP.Su identidad se confirmó mediante Western Blot utilizando anticuerpoanti-histidina y sueros policlonales de ratones inmunizados con sobrenadante deinfección. Para la obtención de los anticuerpos monoclonales se realizaron inmunizacionesde ratones cada 21 días, con el siguiente esquema: dos inmunizaciones con rNS1,la 1° por vía intraperitoneal (serotipos 3 y 4) y la 2° por vía subcutánea(serotipos 1 y 2). Una 3° inmunización fue realizada con una proteína NS1 comercialpor vía intraperitoneal. El título de anticuerpos de los ratones, analizado porELISA, fue satisfactorio, procediéndose a la administración de un boost por víaintraperitoneal con una mezcla de todos los antígenos. Cuatro días luego de laúltima inmunización se extrajeron los esplenocitos del bazo y se fusionaron concélulas SP2/O-Ag14 mediante la adición de PEG 1500. Se realizó la selección delos hibridomas viables suplementando HAT al medio de cultivo. Hibridomassecretores de anticuerpos específicos fueron identificados mediante ELISAdirecto utilizando como antígeno las rNS1 purificadas. La mayoría de loshibridomas obtenidos expresaron anticuerpos que mostraban reactividad contra larNS1 de los cuatro serotipos. Asimismo los hibridomas fueron analizadossensibilizando placas de ELISA con sobrenadante de infección, para evaluar lareactividad contra la proteína en su conformación nativa. Los resultadosobtenidos nos permitieron seleccionar 11 clones, de los cuales 6 fueronelegidos en primera instancia para sub-clonar y caracterizar. En conclusión, se obtuvieron antígenosrecombinantes derivados de la proteína NS1 de los cuatro serotipos del DENV enun sistema procariota, los cuales fueron utilizados para la producción yselección de anticuerpos monoclonales con potencial aplicación en diagnósticoy/o investigación.