Clonado y expresión de la proteína NS1 recombinante del Virus del Dengue en E. Coli y su potencial aplicación en diagnóstico.

MALNERO CRISTIAN; PAREDES ROJAS YESICA; IBAÑEZ, LORENA ITATÍ; BERGMANN INGRID; MALIRAT VIVIANA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Otro; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

El virus Dengue (DENV), arbovirusde la familia <Flaviviridae>, para el cual se han identificado cuatro serotipos,es el agente causal de la fiebre Dengue. En Argentina esta enfermedad sepresenta como epidemias,  resultando  la del  año  en curso  la  peor en  la  historia del  país,  con 41.207 casos confirmados y/o probables en el período epidémico, (hasta lasemana 25), correspondientes en su mayoría al serotipo 1 y en menor proporciónal serotipo 4. Estos datos dejan en evidencia la demanda que  existe de  profundizar  el conocimiento  existente  acerca de  este  agente viral  y  de contar  con métodos  eficaces de  prevención,  diagnóstico y  control.  Actualmente no  se  cuenta con  vacunas  ni terapias antivirales  eficaces  y si  bien  existen disponibles  kits diagnósticos  comerciales,  se  haninformado problemas de reactividad cruzada con otros virus, principalmenteflavivirus. Estos kits son importados y se comercializan a precios elevados Este  trabajo tiene  como  finalidad expresar  la  proteína NS1 del  DENV  en <E.  Coli>  y evaluar preliminarmente la capacidad de la misma para ser utilizada comoantígeno en un kit diagnóstico. Se infectaron células Vero en formaindependiente, con los cuatro serotipos de DENV, y se extrajo el ARN delsobrenadante. La secuencia codificante de la proteína NS1 de cada virus fueamplificada por RT-PCR  y  clonada en  el  vector pET28a.  Las  construcciones  fueron chequeadas  por  digestión enzimática. Para evaluar lasmejores condiciones de  expresión, setestearon diferentes cepas de <E. Coli>, crecimiento  e inducción a diferentes temperaturas, concentraciones de IPTG y medios de cultivo;  visualizándose  los resultados  mediante  SDS-PAGE y/o    Western  Blot utilizando  para  la detección un  anticuerpo  anti-histidina.  Se  consiguió  expresar la  rNS1  del serotipo  3  en la  cepa Rosetta Gami  2 (pLyss) a 37°C,  0,5 mM IPTG, con niveles similares deexpresión en  los  medios Luria, Terrific y Estándar 1. Acontinuación se analizó la expresión de la NS1 correspondiente a los otrosserotipos, obteniendo resultados similares con la misma cepa a 37°C en el medioTerrific y una menor expresión en los otros medios. La purificación de las rNS1-D3fue realizada por electroelución y/o purificación  utilizando  una resina  de  afinidad (Talon  Superflow),  obteniéndose rendimientos semejantes con ambas metodologías. La capacidad antigénicade la rNS1-D3 se evaluó en forma preliminar mediante  un  Western Blot  utilizando  sueros de  ratones  previamente inmunizados  con  los distintos serotipos  de  DENV inactivado.  Se  observó reactividad contra los anticuerpospresentes en dichos sueros. En conclusión, la proteína NS1 del DENV clonada yexpresada en <E. Coli> y purificada mediante electroelución ó columnas deafinidad constituye una herramienta con potencial para ser utilizada en la producción de anticuerposmonoclonales y nanoanticuerpos y en la elaboración de estuches de diagnóstico  para el  DENV.  Así mismo  se  muestra de  utilidad  para ser  aplicada  en  trabajos  de investigación básica.