ESTUDIO POR ESPECTROSCOPIA INFRARROJA EN MODO DE REFLEXION TOTAL ATENUADA DE LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES EN FILMS DE ENZIMAS INDUCIDAS POR EL CONTACTO CON SOLVENTES

ALEJO AGUIRRE; SEBASTIAN COLLINS

Simposio; Simposio Fisica y Quimica de Superficies; 2011

La espectroscopia infrarroja en modo de reflexión total atenuada (FTIR-ATR) es una de las técnicas más importantes para el estudio de materiales biológicos y en general para interacciones en la interfase líquido/sólido. En los últimos años ha crecido la utilización de la espectroscopia FTIR-ATR en estudios in situ, es decir donde es posible “mirar” lo que ocurre dentro del reactor en condiciones normales de operación. Así, es posible estudiar los cambios estructurales en films delgados de biocatalizadores enzimáticos inducidos por cambios controlados en el medioambiente al que están expuestas las moléculas, por ejemplo, por temperatura, pH, presión o solventes. Los experimentos de espectroscopia de excitación modulada (MES) por FTIR-ATR consisten en generar perturbaciones periódicas de un parámetro externo como los mencionados anteriormente. El tratamiento posterior de los espectros mediante el algoritmo de detección sensible a la fase (PSD) permite observar claramente pequeños cambios de intensidad en las señales y correlacionarlos con las variaciones conformacionales de la estructura secundaria de una proteína. En este trabajo se reporta el diseño, construcción y empleo de una celda de flujo pasante de ATR. Esta celda permite un control estricto de las condiciones fluido-dinámicas para realizar perturbaciones controladas mediante el flujo alterno de reactivos y/o solventes en experiencias de MES y monitorear los cambios conformacionales de lipasas de interés tecnológico. Los cambios conformacionales de lipasas de uso comercial de Thermomyces lanuginosa inducidos por el contacto con solventes de diferentes hidrofobicidades, e.g. n-heptano (log P = 7.2) vs isopropanol (log P = 0.05), se estudiaron a través de experiencias de MES monitoreadas por ATR-FTIR a través del modo vibracional Amida I (1700-1600 cm-1). Estos estudios se realizaron sobre films delgados de la lipasa depositada sobre el cristal de ATR de ZnSe. Los resultados obtenidos en este estudio muestran que parte de las cadenas laterales de la enzima, asignados a residuos de Glutamina y/o Acido Aspártico, y los modos de Amida II (1554 cm-1) y Amida I en lámina beta (1629 cm-1) y hélice alfa (1649 cm-1) son afectados por el contacto con los solventes. Claramente se observa que las variaciones estructurales de lámina beta y hélice alfa presentan un menor retardo de fase con respecto al isopropanol, mientras que los residuos de cadenas laterales y el modo de Amida II son más afectados por el cambio de isopropanol a n-heptano.