Influencia de las condiciones de reacción en la hidrólisis enzimática de WPC usando Alcalasa

FENOGLIO C.L.; PIZARRO A.V.; SIHUFE G. A.; MAMMARELLA E.J.

Mar del Plata

Congreso; VI Congreso Argentino de Ingeniería Química; 2010

Asociación Argentina de Ingenieros Químicos

Para desarrollar esta hidrólisis en forma industrial, inicialmente se utilizaron proteasas pancreáticas de origen animal, las que en la actualidad están siendo reemplazadas por las de origen bacteriano o fúngico. En este tipo de procesos, el grado de hidrólisis (DH) está determinado por las condiciones utilizadas: concentración de sustrato, relación enzima/sustrato, tiempo de incubación, pH y temperatura. Otro factor que también va a determinar el DH es la naturaleza de la enzima, la cual también influye en el tipo de péptidos producidos.Dado que las endoproteinasas bacterianas son las enzimas que tienen mayor proyección, en el presente trabajo se estudió la influencia de las condiciones de trabajo sobre la hidrólisis enzimática de WPC, empleando una preparación comercial de la enzima subtilisina (Alcalasa 2.4 L de Novozymes, Dinamarca). Esta enzima fue utilizada para someter a hidrólisis diferentes soluciones adecuadamente acondicionadas de WPC comercial al 35% (Milkaut S.A., Argentina) bajo diferentes condiciones experimentales determinadas mediante el empleo de un diseño experimental central compuesto, rotacional y ortogonal, de cuatro factores (concentración de proteínas, pH, temperatura y tiempo de reacción). De tal manera, se desarrollaron 36 experiencias diferentes acomodadas al azar, con concentraciones de sustrato entre 4 y 10% (m/v), pH entre 8,5 y 9,5, temperaturas entre 40 y 60 ºC y tiempos de hidrólisis entre 10 y 100 minutos. Las condiciones operacionales fueron establecidas de acuerdo a la bibliografía, en la zona donde se han encontrado resultados favorables de reducción de la capacidad antigénica de las proteínas de suero de quesería, con escasa o nula producción de sabor amargo.El control de la hidrólisis enzimática de proteínas a pH alcalino fue realizado de forma sencilla y precisa por medida del consumo de base necesario para mantener constante el pH en el reactor de hidrólisis, de acuerdo al método propuesto por Adler-Nissen (Adler-Nissen J., Enzvmic Hvdrolvsis of Food Proteins. Elsevier Apphed Science Publishers, London and New York, 1986). Sin embargo, este consumo no está relacionado de una forma simple con el DH alcanzado, siendo necesario para establecer esta relación el conocimiento del pK medio de los grupos a-amino liberados en la hidrólisis. En las diferentes experiencias desarrolladas, se obtuvieron diferentes DH que fueron estadísticamente correlacionados con cada una de las variables operacionales establecidas.El análisis de la distribución de tamaños de los péptidos en los hidrolizados producidos, se realizó por RP-HPLC en un equipo Isco (U.S.A.) usando una columna de C18 de 250 x 4,6 mm y 300 Å de tamaño de poro. El análisis de los cromatogramas obtenidos indicó que no existen diferencias sustanciales en el perfil de degradación desarrollado por la enzima, observándose algunas diferencias en las concentraciones de las distintas fracciones. Como resultado de este estudio, se observó que las condiciones de reacción no solo ejercen influencia sobre las constantes cinéticas, sino también sobre la selectividad de la enzima. Este hallazgo podría resultar de suma utilidad para predecir condiciones de hidrólisis que permitan conseguir fracciones de altos DH (> 8%) con escasa o nula acción alergénica, evitando la aparición de umbrales detectables de péptidos con sabor amargo.