El estrés del retículo endoplásmico participa en las alteraciones del transportador de noradrenalina inducido por las endotelinas en la hipertensión sal dependiente.

MERCEDES SCHOLLER; MARIA JULIA GUIL; MARIA FLORENCIA FERNÁNDEZ; MAYRA SEIJAS ; LILIANA G. BIANCIOTTI; MARCELO S. VATTA

CABA

Congreso; 41° Reunión del Consejo Argentino de Hipertensión Arterial; 2020

Consejo Argentino de Hipertensión Arterial

El retículo endoplásmico (RE) es una organela dinámica responsable de la síntesis y correcto plegamiento de las proteínas transmembrana, citosólicas y de exportación, si bien también regula la homeostasis del calcio y la biosíntesis lipídica. Distintos factores afectan la función del RE como alteraciones en la dinámica del calcio, aporte de oxígeno o una mayor demanda de síntesis proteica, los que provocan acumulación de proteínas sin plegar o mal plegadas en el lumen del RE, condición conocida como estrés del RE (ERE). Para restaurar la homeostasis las células poseen sistemas integrados de señalización altamente conservados que incluyen la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) y la degradación asociada al RE (ERAD), los que tienden a disminuir la síntesis proteica global y favorecer la degradación de las proteínas mal plegadas. La UPR es orquestada por tres proteínas residentes del RE (PERK, IRE1 y ATF6) que al activarse estimulan distintas vías de señalización. Si no logra revertirse el ERE, la activación prolongada de la UPR lleva mediante distintos mecanismos a la apoptosis dependiente del RE. Existen evidencias experimentales que señalan al ERE como un mecanismo temprano subyacente al desarrollo de patologías cardiovasculares, como la hipertensión arterial (HTA). Diversos trabajos muestran que el incremento de la actividad catecolaminérgica está implicado en el desarrollo y mantenimiento de la HTA sal dependiente. Particularmente, la médula adrenal es un órgano indispensable, sin el cual la HTA no se desarrolla en ciertos modelos animales de la patología. La remoción de las catecolaminas es un mecanismo crucial que permite la regulación de su actividad. El principal mecanismo está mediado por el transportador neuronal de noradrenalina (NET). Esta proteína transmembrana requiere de múltiples procesos postraduccionales como glicosilaciones y fosforilaciones para ser funcional. Distintos autores mostraron que, en diferentes patologías cardiovasculares como la HTA, la funcionalidad del NET está alterada. Las endotelinas (ETs) son una familia péptidos vasoactivos que, mediante sus receptores ETA y ETB, están íntimamente involucradas en prácticamente todos los aspectos de la regulación de la presión arterial y la homeostasis del sodio. Trabajos de nuestro laboratorio, demostraron que las ETs modulan la actividad y expresión del NET, tanto en animales normotensos como hipertensos DOCA-sal. Este efecto es mediado por diferentes mecanismos que involucran alteraciones del manejo del calcio y de estrés oxidativo. Estos dos mecanismos se encuentran implicados no solo en la HTA, sino en el desencadenamiento del ERE. En base a lo expuesto nuestro objetivo fue demostrar si el ERE participa en las alteraciones del NET inducido por las ETs en un modelo de HTA sal dependiente. Se utilizó el modelo de HTA DOCA-sal, consistente en la inyección subcutánea de 15mg/Kg de DOCA dos veces por semana acompañado de la administración de 1% de NaCl en el agua de bebida. Luego de 4 semanas, se administró oralmente durante 7 días a ratas normotensas e hipertensas una dosis de 1g/Kg/día de Sulfisoxazole (SFX), antagonista dual de los receptores ETA/ETB. Al séptimo día los animales se sacrificaron y se disecó la médula adrenal para realizar estudios de actividad y expresión del NET, microscopía electrónica de transmisión (TEM), expresión de marcadores del ERE y de la apoptosis ERE dependiente por Western Blot y se evaluó la presencia de núcleos apoptóticos por la técnica de TUNEL. Durante todo el desarrollo de los experimentos se determinó la presión arterial sistólica y la frecuencia cardíaca en los grupos experimentales. Los resultados mostraron que el antagonismo de los receptores ETA/ETB disminuyó significativamente la presión arterial sistólica en ratas hipertensas DOCA-Sal. En los animales hipertensos la actividad del NET y la expresión proteica de la porción funcional del transportador disminuyeron, pero el tratamiento con SFX reestableció la actividad del NET y parcialmente los niveles de la proteína funcional. En las ratas DOCA-sal se observó una alteración de la ultraestructura de las células cromafines compatible con ERE (expansión del RE, edema, mitocondrias con disrupciones en sus membranas, interdigitación nuclear y vacuolización). Sin embargo, el tratamiento con el antagonista ETA/ETB reestableció la ultraestructura celular. Asimismo, los animales hipertensos mostraron un incremento en la expresión de los marcadores de ERE correspondientes a las vías de IRE1 y PERK. Las proteínas medidas fueron:GRP78: chaperona que se encuentra unida a las proteínas transmembrana sensoras del ERE (PERK, IRE1 y ATF6) residentes del RE. Ante una sobrecarga del RE, GRP78 se separa de éstas para asistir en el plegamiento de proteínas nacientes.• IRE1: proteína sensora de la membrana del RE, normalmente acoplada de GRP78. Al activarse se homodimeriza y transfosforila adquiriendo función de endoribonucleasa.• XBP1: factor de transcripción que aumenta la síntesis de proteínas chaperonas para ampliar la capacidad de plegado del RE.• pPERK: al igual que IRE1, es una proteína sensora de la membrana del RE, normalmente acoplada de GRP78. Al activarse se homodimeriza y transfosforila adquiriendo función de quinasa.• peIF2α: factor de transcripción que induce inhibición ribosomal y atenuación de la síntesis global de proteínas.• CHOP: factor de transcripción implicado en la regulación de la apoptosis ERE dependiente.Los resultados mostraron que el antagonista ETA/ETB en animales hipertensos disminuyó la expresión de estos marcadores de ERE. Al estudiar la apoptosis ERE dependiente mediante la técnica de TUNEL se observó que los animales hipertensos presentaron un elevado número de núcleos apoptóticos los que fueron significativamente reducidos en presencia del antagonista ETA/ETB. Asimismo, los animales hipertensos mostraron un aumento en la expresión de las proteínas marcadoras de apoptosis dependiente de ERE (Bak, Bax y caspasa 12), que se redujo a valores normales por el tratamiento con SFX.En base a los resultados obtenidos podemos concluir que en el modelo de HTA DOCA-Sal se produce una disfunción del NET en la médula adrenal por disminución de su glicosilación causado por un incremento del ERE y de la apoptosis ERE dependientes. El tratamiento crónico con SFX redujo la presión arterial sistólica, incrementó la funcionalidad del NET y redujo los marcadores del ERE y de la apoptosis ERE dependiente. Estos hallazgos muestran claramente que el antagonismo de los receptores de endotelinas posee un efecto beneficioso en la HTA sal dependiente.