µFLUO: una plataforma de adquisición de fluorescencia automatizada para estudiar la dinámica de interacción bacteria-bacteria y planta-bacteria

PAGNUSSAT, LUCIANA A.; PARODI, PABLO S.; MARONICHE, GUILLERMO A.; DÍAZ, PABLO R.; AMENTA, MELINA; CREUS, CECILIA M.; ARENAS GUSTAVO F.

Mar del Plata

Jornada; II Jornadas de Investigación de la UNMdP - INVESTIGAR 2020; 2020

Universidad Nacional de Mar del Plata

Una de las estrategias experimentales más utilizada en el estudio de biofilms bacterianos y asociaciones rizobacteria-raíz es el uso de cepas que expresan proteínas fluorescentes para realizar un seguimiento in vivo del crecimiento, colonización y establecimiento bacteriano en diferentes soportes. Con el objetivo de desarrollar una plataforma que nos permita registrar la dinámica de dichos procesos por fluorescencia a escala macroscópica y en tiempo real, establecimos una colaboración entre el Laboratorio de Bioquímica Vegetal y Microbiana (LBVM) de la FCA-UNMdP y el Laboratorio LASER (LL) de la FI-UNMdP. El diseño estructural y funcional de gran parte de la plataforma se basó en el proyecto FluoPi , a partir del cual se realizaron diversas mejoras y modificaciones. En las reuniones entabladas entre ambos Laboratorios se determinaron las características principales del equipo a diseñar y construir, entre las que se destacan: tres fuentes de luz LED de excitación en diferentes longitudes de onda (UV, azul y verde), cámara digital de alta resolución y bandeja de filtros ópticos para la cámara (filtros BP 450, 530 y 610 nm), todo dispuesto dentro de una recamara oscura donde se colocarían las muestras a analizar. La interfaz de control del equipo, captura y visualización de imágenes fue desarrollada en Python y embebida en una computadora Raspberry Pi 3. De esta manera el equipo desarrollado en el LL admite la conexión de un monitor, teclado y mousse para capturar, de manera manual o automática, imágenes de fluorescencia de muestras previamente colocadas en su recamara. Se utilizó el prototipo desarrollado, bautizado como µFLUO, para analizar la formación de biofilms mixtos de tipo macrocolonia entre Azospirillum brasilense Sp245 (expresando la proteína roja fluorescente mCherry) y Pseudomonas fluorescens A506 (expresando la proteína verde fluorescente EGFP) sobre medio agarizado. El equipo permitió la separación espectral de ambos fluorofóros (Figura 3a), demostrando que la interacción interespecífica resulta en la estimulación del crecimiento de A. brasilense Sp245 y la inhibición en el crecimiento de P. fluorescens A506 (Figura Xb3b). El análisis de los biofilms mixtos reveló que la interacción entre A. brasilense Sp245 y P. fluorescens A506encuadra dentro de lo que se describe en la socialización bacteriana como cooperación altruista (2).Si bien se han cumplido, en su mayoría, las pautas y exigencias iniciales al momento de comenzar el proyecto, tanto los resultados finales como el proceso de construcción y pruebas han demostrado la versatilidad y potencial de la plataforma. Es así que actualmente se encuentra en desarrollo una ampliación del equipo que contempla la automatización de la bandeja de filtros ópticos y la posibilidad de realizar experiencias más complejas de manera automática. En la versión ampliada el usuario podrá programar su secuencia de trabajo automatizando las capturas secuenciales eligiendo las longitudes de onda de excitación y los filtros ópticos para cada etapa.