Obtencion de laminas de mioblastos diafragmaticos ovinos geneticamente modificados para regeneracion miocardica

C.S. GIMENEZ; R. RAMIREZ; F.D. OLEA; A. HNATIUK; T.M. RODRIGUEZ; G.A ABRAHAM; R. LAGUENS; A. CROTTOGINI

Mar del Plata

Congreso; LIX Reunion Cientifica Anual de la Sociedad Argentina de Investigacion Clinica (SAIC) y LXII Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Inmunolog¡a (SAI); 2014

Soc. Argentina de Investigacion Clinica

Dado que el diafragma se compone de fibras tipo I de gran resistencia al estres y alto umbral de agotamiento que le permite contraerse unas 20 veces/min durante toda la vida, los mioblastos diafragmaticos (MD) serian una opcion mas adecuada que los de otros musculos esqueleticos para terapias cardio-regenerativas. Nos propusimos aislar, cultivar y caracterizar MD ovinos, transducirlos con el gen de conexina 43 (cx43) para promover la conexion entre celulas, y crecerlos sobre diferentes andamios (scaffolds) para su aplicacion sobre areas infartadas en forma de laminas. Metodos: Se obtuvieron biopsias de diafragma ovino que se digirieron con colagenasa. Los MD extraidos se cultivaron sobre un feeder layer de macrofagos (FLM) autologos activados, se caracterizaron con anticuerpos anti-desmina, a-actina sarcomerica, SERCA-2-ATPasa y Ki-67, y por expresion del gen miogenico myoD (RT-qPCR). Los MD se transdujeron con lentivirus portadores del gen de cx43 y de la proteina verde fluorescente (GFP), previa medicion de la eficiencia de transduccion (ET) de diversas multiplicidades de infeccion (MOI). Finalmente, se cultivaron los MD sobre scaffolds de pericardio bovino (PB; n=8), acido polilactico (PLLA; n=8), y matriz extracelular de vejiga de cerdo (ECM; n=8), y se midio la confluencia (C) a 4 dias por un score de 0 a 5, siendo 0: 0%C, 1: 1-20%C, 2: 21-60%C, 3: 41-60%C, 4: 61-80%C y 5: 81-100%C. Resultados: Los MD crecieron satisfactoriamente sobre el FLM y fueron positivos para los anticuerpos probados y para el gen de myoD. Con MOI=100 se logro una ET de 70,8% y expresion evidente de Cx43. El score de C fue 0 en PB, 2,6+/-1,1 en ECM y 4,75+/-0,5 en PLLA, (p<0,0001 vs. PB y ECM; X+/-DS, ANOVA-Bonferroni). Conclusion: Los MD fueron exitosamente aislados, cultivados y transducidos. El andamio de PLLA fue el mas apropiado para generar laminas. Estos resultados son el primer paso hacia pruebas de eficacia terapéutica en modelos ovinos de infarto de miocardio.